Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Identifikation, Expression und Antigencharakterisierung von Paramyosin des Hakenwurms Ancylostoma caninum

Hüsken, Ricarda

Immunization trials against hookworms began in the 1930s and led to the development of a “canine hookworm vaccine”, which was based on gamma-irradiated attenuated larvae. Despite its efficacy, the vaccine did not succeed commercially and was taken off the market after a few years. Since promising immunization results with immunogenic antigens were obtained, development of a recombinant vaccine seems to be feasible. A potential vaccine candidate is paramyosin, which was first identified as a structural component in the thick filaments of invertebrate muscle. The immunogenicity of paramyosin and a surface exposition of this protein have been described in other helminths. To complete the known part of Ancylostoma caninum Paramyosin, a ”5´-Rapid Amplification of cDNA-Ends” was used. The full-length sequence contains an open reading frame of 2631 bp and shows 81 % identity to paramyosin of Dictyocaulus viviparus and Caenorhabditis elegans. The genomic sequence consists of 20 introns. The protective potential of paramyosin was tested in immunization trials with Balb/c mice.  In order to immunize with recombinant protein, paramyosin was expressed as a glutathione-S-transferase (GST)-fusion protein in E. coli and was purified by affinity chromatography and gelfiltration. Immunization groups received the fusion protein emulsified with the adjuvants aluminium hydroxide, Quil A or STP (Squalane, Tween 80, Synperonic L121). Although specific IgG1 und IgG2a antibodies were detected in all vaccination groups by ELISA, the recombinant protein induced reduction of larvae only in the paramyosin-STP group, but without statistical significance. For a DNA-Vaccine the cDNA-Sequence coding for Paramyosin was cloned into an expression vector, suited for the expression in mammalian cells. Immunization groups received Plasmid-DNA or a DNA-prime and a protein-boost. Like the protein trial, specific antibodies could be detected in each vaccination group. Nevertheless a statistically significant reduction of larvae (64 %) could only be induced in the DNA-prime protein-boost group.

Immunisierungsversuche gegen Ancylostoma canium wurden seit den frühen 30er Jahren unternommen und führten zur Entwicklung einer Hakenwurmvakzine, die auf röntgenattenuierten Larven beruht. Trotz der recht guten Wirksamkeit wurde die Vakzine jedoch u.a. aus wirtschaftlichen Gründen wieder vom Markt genommen. Viel versprechende Immunisierungsergebnisse mit immundominanten Antigenen lassen jedoch die Entwicklung eines Impfstoffs auf der Basis rekombinanter Antigene möglich erscheinen. Einen potentiellen Vakzinekandidaten stellt Paramyosin dar; ein Protein, das zuerst als Bestandteil der dicken Filamente in der Muskulatur von Invertebraten identifiziert wurde. In Immunisierungs- und Immunlokalisationsstudien mit Paramyosin verschiedener Helminthen konnte das immunogene Potential und zudem auch eine Oberflächenexposition des Proteins beschrieben werden. Die aus vorangegangenen Arbeiten im Institut bekannte Teilsequenz von Paramyosin konnte mittels 5´-Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) vervollständigt werden und weist einen offenen Leserahmen über 2631 bp auf, der eine 81 % Identität zu Paramyosin von Dictyocaulus viviparus und Caenorhabditis elegans zeigt. Auf genomischer DNA-Ebene konnten sechs weitere Introns identifiziert werden, sodass sich die Anzahl der Introns auf 20 beläuft. Die Überprüfung des protektiven Potentials von Paramyosin erfolgte in Immunisierungsversuchen mit Balb/c-Mäusen. Für einen Protein-Immunisierungsversuch wurde Paramyosin als Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (GST) in E. coli exprimiert und mittels Affinitäts-Chromatographie und Gelfiltration aufgereinigt. Das rekombinante Protein wurde in den verschiedenen Impfgruppen in Kombination mit den Adjuvantien Aluminiumhydroxid, Quil A und STP (Squalane, Tween 80 und Synperonic L121) appliziert. Obwohl bei allen immunisierten Mäusen im ELISA spezifische IgG1- und IgG2a-Antikörper nachgewiesen wurden, konnte nur in der STP-Paramyosin-Impfgruppe eine Reduktion der Larvenzahl um 30 % erzielt werden, die jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Für eine DNA-Vakzine wurde die für Paramyosin kodierende Sequenz in einen die Expression in Säugetierzellen ermöglichenden Vektor kloniert. Die Impfgruppen erhielten entweder nur Plasmid-DNA oder eine Kombination aus DNA-Prime und Protein-Boost. Wie im Protein-Iimmunisierungsversuch konnten auch in diesem Versuch in allen Impfgruppen spezifische Antikörper nachgewiesen werden, jedoch wurde nur in der DNA/Protein-Impfgruppe eine statistisch signifikante (p = 0,004; Mann-Whitney Rank Sum Test) Reduktion der Larven um 64 % erzielt.

Quote

Citation style:

Hüsken, Ricarda: Identifikation, Expression und Antigencharakterisierung von Paramyosin des Hakenwurms Ancylostoma caninum. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export