Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunhistochemische Untersuchungen an Darmbiopsien zur Verteilung der Lymphozyten und Makrophagen im GALT-System von Rhesusaffen nach experimenteller SIV-Infektion

Janetzko, Thea Anna Maria

The aim of this research was an immunohistochemical investigation of intestinal biopsies to determine on the distribution and the ratio between different immunocompetent cells with  emphasis on  CD4 and CD8 positive cells in the course of an experimental intravenous or intrarectal SIV infection (SIVmac251/MPBMC). Biopsies of the mucosa of duodenum and colon of eight Rhesus monkeys (Macaca mulatta) were taken in an interval of 3 days to 36 weeks post infectionem and examined immunohistochemical using monoclonal antibodies specific for CD3, CD4, CD8, CD20, and CD68. The biopsies were also used by the research group for gastroenterology at the department for internal medicine, University Homburg/ Saar (Germany) for FACS analyses of CD4 and CD8- positive cells. Their results and the results of the virology department  of the DPZ, that worked with blood- CD4 and CD8-positive cells of these animals, were compared to the results of this study. The following results were found out: ·        The evaluation revealed no significant differences between the biopsies with regard to the CD68 macrophages and the CD20 positive B-lymphocytes during the course of the infection. The CD3 positive T-lymphocytes showed a slight decrease in the course of infection.   ·        While immunhistological investigations showed a decreasing number of CD4 cells in the course of infection, it was impossible to prove the presence of CD8 positive cells in paraplast embedded material because of the absence of a, on CD8-positive cells reacting, antibody.   ·        Using the quantitative evaluation of the CD4 and CD3 cells, the number of CD8 cells was determined by calculation. This showed a decrease of the CD4/CD8 ratio in every animal in the first weeks to approximately zero.   ·        No significant differences between intravenous and intrarectal infected monkeys were detected.   ·        The comparison of the results of evaluated biopsies and the blood samples showed an agreement of the results of the investigations of CD4 and CD8 and their ratio. Only the blood parameters showed a slight increase after the second week post infection.   In conclusion it can be stated that a short time post infection either intrarectaly or intravenously the intestinal GALT-system reacts with a shift in the different immunocompetent cells. The shift is mainly a result of the decrease of the CD4 positive cells. The changes closely reflect the changes in the periphere blood. The endoscopy is an outstanding method for taking tissue in a minimum invasive way for analysing the reaction of the GALT-system in a very early stage of infection. For the evaluation of the biopsies it is more efficient to use FACS-analysis than the method used in this study.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, Aussagen zur Verteilung und zum Verhältnis der Lymphozytensubpopulationen und Makrophagen mit Schwerpunkt auf den CD4- und CD8-positiven Zellen im Verlauf einer experimentellen intravenösen oder intrarektalen SIV-Infektion (SIVmac251/APBM) zu treffen. Dazu wurden Biopsien von Duodenum und Colon von acht Rhesusaffen (Macaca mulatta) über einen Zeitraum von drei Tagen bis zu 36 Wochen nach der Infektion gewonnen und immunhisto-chemisch über die Streptavidin-Biotin-Komplexmethode auf das Vorkommen CD3-, CD4-, CD8-, CD20- sowie CD68-positiver Zellen untersucht. Neben Biopsien wurde weiteres Sektionsmaterial in die Auswertung einbezogen, das zwischen der 15. und 20. Woche post infectionem bei den intrarektal infizierten und zwischen der 23. und 32. Woche bei den intravenös infizierten Tieren anfiel. Die Ergebnisse wurden außerdem mit Ergebnissen aus Proben dieser Tiere verglichen, die aus hämatologischen Untersuchungen der Abteilung für Virologie des DPZ sowie aus Untersuchungen an Biopsien der Arbeitsgruppe Gastroenterologie der Abteilung Innere Medizin, Universität Homburg/ Saar, gewonnen wurden.   Folgende Ergebnisse wurden erzielt: ·        Bei der Auswertung konnten im Infektionsverlauf keine signifikanten Unterschiede zwischen den Biopsien hinsichtlich CD68-positiver Makrophagen und CD20-positiver B-Lymphozyten festgestellt werden. Die CD3-positiven T-Lymphozyten zeigen einen leichten Rückgang im Infektionsverlauf. ·        Während mit den immunhistochemischen Analysen der CD4-positiven Zellen im Infektionsverlauf ein Rückgang dieser Zellen dargestellt werden konnte, gelang es nicht, reproduzierbar CD8-positive Zellen immunhistochemisch an in Paraplast eingebettetem Material nachzuweisen. ·        Über Auszählung der CD4- und CD3-positiven Zellen wurde rechnerisch auf die CD8-positive Zellpopulation durch Subtraktion der Anzahl der CD4-positiven Zellen von der Anzahl der CD3-positiven Zellen geschlossen. Dabei zeigte sich, dass die CD4/CD8-Ratio bei allen Tieren innerhalb der ersten Infektionswochen stark abfällt und gegen Null strebt. ·        Signifikante Unterschiede zwischen intravenös und intrarektal infizierten Tieren wurden nicht festgestellt. ·        Der Vergleich der Ergebnisse aus den Biopsieproben und den analog entnommenen Blutproben ergab eine relative Übereinstimmung der prozentualen Anteile für CD4 und CD8 sowie deren Ratio. Lediglich im But gab es einen leichten Anstieg der CD4/CD8-Ratio nach der zweiten Infektionswoche.   Abschließend lässt sich sagen, dass das GALT-System schon kurze Zeit sowohl nach intrarektaler als auch intravenöser Infektion mit Verschiebungen innerhalb der verschiedenen Lymphozytensubpopulationen reagiert, die im wesentlichen auf eine Abnahme der CD4-positiven Zellen zurückzuführen ist. Die Veränderungen entsprechen weitestgehend jenen im peripheren Blut. Die Untersuchung von Biopsien stellt eine minimalinvasive Möglichkeit der Materialgewinnung dar, während der Auswertung der Proben mit Hilfe der Durchflußzytometrie  gegenüber der in dieser Arbeit dargestellten Methode den Vorzug gegeben werden sollte.  

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Janetzko, Thea Anna Maria: Immunhistochemische Untersuchungen an Darmbiopsien zur Verteilung der Lymphozyten und Makrophagen im GALT-System von Rhesusaffen nach experimenteller SIV-Infektion. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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