Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

Koppe, Sophie

Aim of this study was to optimize and validate a suitable method for the analysis detection and quantification of theophylline, theobromine and the metabolites paraxanthine and caffeine in blood and urine samples of horses and to investigate the pharmacokinetic behaviour of caffeine and theobromine.   Validation and measurement of samples was made by using a high performance liquid chromatograph (HPLC) with connected tandem-mass-spectrometer. Validation contained the criteria selectivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The limit of quantification for theophylline, theobromine, paraxanthine and caffeine was fixed at 100 ng/ml in plasma and at 50 ng/ml in urine for theophylline, paraxanthine and caffeine. For theobromine it was fixed at 100 ng/ml. The limit of detection was found at 13 ng/ml for theophylline, at 15 ng/ml for theobromine, at 14 ng/ml for caffeine and at 29 ng/ml for paraxanthine in plasma. In urine the limit of detection was found at 20 ng/ml for theophylline, at 26 ng/ml for theobromine, at 33 ng/ml for caffeine and at 32 ng/ml for paraxanthine.   Theophylline was administered to six horses at a single intravenous dose of 4 mg/kg body weight, theophylline at a single oral dose of 4 mg/kg body weight, or theobromine at a single intravenous dose of 4 mg/kg body weight. Maximum concentrations of theophylline in plasma after intravenous administration ranged between 5165 and 8834 ng/ml. Maximum theophylline concentrations in urine ranged between 21636 and 93373 ng/ml. 60 hours after administration urine concentrations of all six horses were not below limit of quantification. In plasma and urine the metabolites paraxanthine and caffeine were detectable. But caffeine concentrations were mainly around limit of detection. Theobromine was not detectable.   Maximum concentrations of theophylline in plasma after oral administration ranged between 1791 and 3483 ng/ml. Maximum concentrations of theophylline in urine ranged between 16365 and 41256 ng/ml. 108 hours after administration the urine concentration of only one horse was below limit of quantification. In plasma and urine the metabolite paraxanthine was detectable. After administration of theobromine its maximum concentrations in plasma ranged between 5715 and 12402 ng/ml and in urine between 65771 and 94889 ng/ml. 168 hours after administration all urine concentrations of the six horses were still above limit of detection. No metabolites could be detected in plasma and urine. Using the pattern of metabolites the parent substance can be concluded. If there is detected almost sole theobromine in plasma or urine, application of theobromine can be submitted, and if there is detected theophylline and paraxanthine in plasma or urine, application of theophylline can be submitted.   Afterwards the results were integrated into a pharmacokinetic/pharmacodynamic approach of TOUTAIN and LASSOURD (2002) to calculate the irrelevant plasma and urine concentrations where caffeine has no effect on the organism anymore. Calculation of effective plasma concentration, irrelevant plasma concentration and irrelevant urine concentration by the pharmacokinetic/pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) showed that for theophylline the irrelevant plasma concentration (at 14 ng/ml) and urine concentration (at 40 ng/ml) at a dosing interval of 12 hours are below respectively at limit of detection. Therefore it is concluded that any detection of theophylline in plasma or urine by this method has to be considered as a positive result of dopingtest. That is why an establishment of a selected cut-off value for therapeutics seems not to be acceptable for theophylline. In addition a considerable variance of measured data demonstrates the interindividual variability. It must be concluded that a prediction about excretion times of theophylline and theobromine based on this data by a small number of probands is not reliably possible. Any detection of theophylline in plasma or urine samples should be considered as relevant for doping and should be punished appropriately.

Ziel der vorliegenden Arbeit war, neben der Optimierung und Validierung einer geeigneten Analysemethode zur Detektion und Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin sowie der Metaboliten Paraxanthin und Coffein im Plasma und Urin von Pferden, die Untersuchung des pharmakokinetischen Verhaltens von Theophyllin und Theobromin.   Die Validierung und Messung der Plasma- und Urinproben erfolgte auf einem Hochflüssigkeitschromatographen mit angeschlossenem Tandemmassenspektometer. Die Validierung umfasste die Kriterien Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die Quantifizierungsgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein betrugen im Plasma 100 ng/ml und im Urin 50 ng/ml für Theophyllin, Paraxanthin und Coffein und 100 ng/ml für Theobromin. Die Detektionsgrenzen im Plasma lagen bei 13 ng/ml für Theophyllin, 15 ng/ml für Theobromin, 14 ng/ml für Coffein und 29 ng/ml für Paraxanthin. Im Urin wurden Nachweisgrenzen von 20 ng/ml für Theophyllin, 26 ng/ml für Theobromin, 33 ng/ml für Coffein und 32 ng/ml für Paraxanthin ermittelt.   In drei Versuchsabschnitten wurden jeweils sechs Pferden einmalig 4 mg/kg Körpergewicht Theophyllin intravenös, einmalig 4 mg/kg Körpergewicht Theophyllin oral bzw. einmalig 4 mg/kg Körpergewicht Theobromin intravenös verabreicht und anschließend über einen Zeitraum von 60 bis 108 Stunden Plasma- und Urinproben entnommen. Nach intravenöser Applikation von Theophyllin lagen die Maximalkonzentrationen von Theophyllin im Plasma in einem Bereich von 5.165 bis 8.834 ng/ml und im Urin bei 21.636 bis 93.373 ng/ml. Über den Zeitraum der Urinprobenentnahmen von 60 Stunden fiel bei keinem Pferd die Urinkonzentration unter die Quantifizierungsgrenze von 50 ng Theophyllin pro ml Urin. Es wurde sowohl im Plasma als auch im Urin der Metabolit Paraxanthin nachgewiesen, Coffein war in Spuren im Bereich der Nachweisgrenze erkennbar, Theobromin wurde nicht nachgewiesen. Nach oraler Verabreichung von Theophyllin konnten Maximalkonzentrationen von Theophyllin im Plasma in Höhe von 1.791 bis 3.483 ng/ml und im Urin in Höhe von 16.365 bis 41.256 ng/ml gemessen werden. Lediglich bei einem Pferd sank die Urinkonzentration innerhalb des Probenentnahmezeitraumes von 108 Stunden unter die Quantifizierungsgrenze von 50 ng/ml. Es wurde wie nach intravenöser Applikation nur der Metabolit Paraxanthin nachgewiesen. Nach intravenöser Applikation von Theobromin lagen die Maximalkonzentrationen von Theobromin im Plasma bei Werten von 5.715 bis 12.402 ng/ml und im Urin bei 65.771 bis 94.889 ng/ml. Über den Zeitraum der Urinprobenentnahmen von 168 Stunden fiel bei keinem Pferd die Urinkonzentration unter die Nachweisgrenze von 26 ng Theobromin pro ml Urin. Es wurde sowohl im Plasma als auch im Urin weder Theophyllin, Paraxanthin noch Coffein in quantifizierbarer Menge nachgewiesen. Somit kann anhand des nachweisbaren Metabolitenmusters eindeutig auf die verabreichte Muttersubstanz geschlossen werden. Wird lediglich Theobromin nachgewiesen, ist reines Theobromin verabreicht worden. Werden Theophyllin und Paraxanthin nachgewiesen, ist Theophyllin appliziert worden.   Die ermittelten Ergebnisse wurden anschließend pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen und mit Hilfe des PK-/PD-Modells nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) quantitativ verknüpft. Durch diese Berechnungen wurden sogenannte irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen ermittelt, bei denen eine Wirkung von Theophyllin auf den Organismus ausgeschlossen werden kann. Die ermittelte irrelevante Plasmakonzentration in einem Dosisintervall von 12 Stunden lag bei 14 ng/ml und die irrelevante Urinkonzentration bei 40 ng/ml, und somit unter bzw. im Bereich der Nachweisgrenzen von Theophyllin in den verschiedenen Matrices. Daraus lässt sich schließen, dass jeder Nachweis von Theophyllin im Plasma oder im Urin anhand der beschriebenen Analysemethode als positiver Dopingbefund zu betrachten ist. Deswegen erscheint die Einführung eines Grenzwertes für Theophyllin nicht sinnvoll. Außerdem kann aufgrund der erheblichen interindividuellen Streuung und geringen Anzahl von Probanden keine absolut sichere Aussage über die Ausscheidungszeiten von Theophyllin und Theobromin gemacht werden. Jeglicher Nachweis von Theophyllin im Plasma oder im Urin sollte als dopingrelevant gelten und entsprechend geahndet werden.

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Koppe, Sophie: Untersuchungen zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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