Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Bedeutung von Leukozyten-Chimärismus für das immunologische Schicksal porciner allogener Lungentransplantate

Kruse, Bianca

High levels of donor cell chimerism after organ transplantation are supposed to result in a better graft acceptance. The aim of this work was to analyze a possible correlation between high donor leukocyte levels in lung transplanted minipigs and transplantation outcome. Single sided left lung transplantation was performed in MHC I and sex mismatched female minipigs. Intravenous pharmacologic immunosuppression was maintained for 28 postoperative days. A defined number of animals received a preoperative irradiation and/or donor specific immature dendritic cells. The pigs were subdivided into a group that rejected acutely (n=16) and animals who accepted their grafts long term (>POD 178, n=11). For chimerism analysis recipient PBMC were tested for the fraction of donor leukocytes with the aid of two methods: SLA I 741110, an antigen exclusive for donor leukocytes, was analyzed by flow cytometry. Y chromosomal peripheral blood donor leukocytes were detected by SybrGreen R real-time PCR. Flow cytometry was only suitable for macrochimerism analysis. Before transplantation the number of 741110(+) lymphocytes was below detection limit. One hour after reperfusion donor lymphocyte levels increased to a maximum level and still remained above base line on POD 1. In comparison to the group of rejecting animals long term survivors had weakly significant higher donor leukocyte numbers on POD 1h. In both groups 741110(+) lymphocytes continuously decreased to base line until POD 70. Due to a higher sensitivity real-time PCR was also valid for microchimerism analysis. In none of the recipients Y-chromosomal DNA was detectable before transplantation. Both groups showed highest levels one hour after reperfusion, whereas the number of donor cells was significantly higher in long term survivors. Y-chromosomal DNA levels dropped back to almost base line until POD 70, however in both groups small amounts of Y-chromosomal DNA remained detectable. This persistent microchimerism was more distinctive in the group of long term survivors. In this model higher donor lymphocyte levels immediately after transplantation improved graft acceptance. In conclusion chimerism seems to play an important role for the induction, but not for the maintenance of tolerance in lung transplanted pigs. Higher chimerism levels induced a peripheral transplantation tolerance which was maintained by CD4(+)-CD25(+) regulatory T-cells. However no tested protocol reliably created postoperative chimerism levels high enough to induce transplantation tolerance in all animals. How to achieve this goal needs to be further examined.

Hohe Spenderzellchimärismusanteile nach Transplantationen werden mit einer erhöhten Transplantatakzeptanz in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit wurde überprüft, ob ein Zusammenhang zwischen den postoperativen Gehalten spenderspezifischer Leukozyten im Blut lungentransplantierter Minipigs und dem Transplantatüberleben besteht. In 27 geschlechts- und MHC I inkompatiblen weiblichen Minipigs wurde eine linksseitige Einzellungentransplantation vorgenommen. Zur Toleranzinduktion erfolgte in den ersten 28 postoperativen Tagen eine medikamentöse immunsuppressive Therapie, in definierten Fällen kombiniert mit einer präoperativen Bestrahlung und/oder der Transfusion unreifer spenderspezifischer dendritischer Zellen. In Abhängigkeit vom Transplantatüberleben wurden die Schweine in eine Gruppe langzeitüberlebender Tiere (>POD 178, n=11) und eine Abstoßergruppe (n=16) eingeteilt. Im Rahmen der Chimärismusanalyse wurden die PBMC der Schweine auf den Anteil an Spenderleukozyten untersucht. Dabei kamen zwei Methoden zum Einsatz: mittels Durchflusszytometrie wurde das SLA I 741110 analysiert, das sich nach prospektivem Mismatch ausschließlich auf den Spenderzellen befand. Desweiteren wurde eine SybrGreen R real-time PCR etabliert, um Y-chromosomale dsDNA in den weiblichen Empfängertieren zu detektieren. Ein Makrochimärismus ließ sich mithilfe der Durchflusszytometrie zuverlässig nachweisen. Vor Transplantation lag der Anteil 741110(+) Lymphozyten in beiden Gruppen unterhalb von 1 %. Die Spenderzellzahl erreichte eine Stunde nach Reperfusion ihren Maximallevel, an POD 1 zeigte sie sich bereits rückläufig, aber noch deutlich über dem Basisspiegel. Zum postoperativen Zeitpunkt 1h war die Spenderzellzahl in den LZÜ, verglichen mit den Abstoßern, schwach signifikant erhöht. Bis POD 70 ging der Anteil 741110(+) Lymphozyten in beiden Gruppen kontinuierlich bis auf den Basalwert zurück. Aufgrund einer höheren Sensitivität war die real-time PCR auch zum Mikrochimärismusnachweis geeignet. Vor Transplantation lag der Anteil Y-chromosomaler DNA in allen Empfängertieren bei 0 %. Der Maximallevel war auch hier in beiden Gruppen zum postoperativen Zeitpunkt 1h messbar, in den LZÜ ließen sich zu diesem Zeitpunkt signifikant mehr Spenderzellen detektieren als in den abstoßenden Tieren. Der Anteil Y-chromosomaler DNA ging bis POD 70 kontinuierlich bis annähernd auf den Ausgangsspiegel zurück, in beiden Gruppen blieben allerdings kleinste Mengen in Form eines persistenten Mikrochimärismus nachweisbar. Dieser war in den langzeitüberlebenden Tieren gegenüber den Abstoßern im Mittel ausgeprägter. In diesem Modell korrelieren erhöhte Spenderzellanteile im direkten postoperativen Zeitraum mit einer verbesserten Transplantatakzeptanz. Somit scheint Chimärismus für die Induktion, nicht aber die Aufrechterhaltung von Transplantattoleranz in lungentransplantierten Minipigs von Bedeutung zu sein. Durch erhöhte Chimärismuslevel im direkten postoperativen Zeitraum ließ sich eine periphere Transplantattoleranz induzieren, an deren Aufrechterhaltung CD4(+)-CD25(+) regulatorische T-Zellen beteiligt waren. Allerdings erzeugte kein Protokoll zuverlässig einen genügend hohen Spenderzellanteil, um bei allen Tieren eine tolerogene Immunantwort einzuleiten und die Transplantatabstoßung zu verhindern. Auf welche Weise und mit welchen Zellpopulationen dies möglich ist, bedarf der weiteren Untersuchung.

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Kruse, Bianca: Bedeutung von Leukozyten-Chimärismus für das immunologische Schicksal porciner allogener Lungentransplantate. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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