Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Übertragung von Koi-Herpesvirus-Infektionen durch symptomlose Carrierfische

Meyer, Kirsten

In the past, carp populations were frequently infected through the acquisition of symptomless virus carriers that were infected with the koi herpesvirus (KHV). KHV induces disease which can lead to high mortalities, and therefore to high economic losses and impairs the human food supply. Outbreaks of the disease were observed especially in carp populations after stressful situations, such as long transport times, shifts of keeping conditions or infections with additional pathogenic agents. In this study it was examined if KHV, like other herpesviruses, can persist in an inactive form over a long period of time in the organism, and if situations of stress or immunosuppression can reactivate virus shedding. It was examined whether a specific exposure to KHV could induce or increase the excretion of infectious virus in koi after a natural infection and in carp that had survived a laboratory infection, even when the virus could not be detected anymore through molecular biological methods in these fish. Fish that were raised under virus-free conditions were infected in the laboratory by co-habitation with a KHV-infected koi showing infection symptoms. Then the temperature was raised to 30-32°C for four weeks. The fish were then kept for an additional four weeks at 23°C. At the beginning of the experiment fish were co-habitated without any stressor to examine if infectious virus was spontaneously excreted. Subsequently, latently infected carriers were exposed to a simulated capture, a simulated transport, an infection with the blood parasite Trypanoplasma borreli, an immune suppressing corticosteroid and an oral reinfection with KHV. The influence of the stressors on the excretion of infectious virus was examined through cohabitation of the stressed fish with naive carp and subsequent PCR-examination of the co-habitated naïve carp. Results show that stress situations and a reinfection with KHV can induce a virus-reactivation and can lead to excretion of infectious virus in fish that were latently infected with KHV. It was to an extent unclear if other fish species can also contribute to further spreading of the virus. Therefore grass carp, tench, goldfish and silver carp that were exposed to KHV and cohabitated with naive carp, were examined for KHV by means of PCR. In the tissue of all examined fish species KHV-specific DNA could be detected, and also in the tissue of naive carp which were cohabitated with individuals from the examined species. Experiments to vaccinate carp with a formal-inactivated and a heat-inactivated virus suspension were conducted. A good protection against KHV was not obtained, neither through bath treatment, nor through intraperitoneal, rectal or oral application of the vaccine. At present no uniform PCR-method for KHV-detection is used in different research laboratories. Therefore it was tested if the examination of tissue samples by different PCR methods leads to uniform results. DNA was isolated from tissue samples of an infected goldfish, an infected carp and three infected koi with several different extraction methods. This DNA was used to examine different combinations of primer pares and polymerases. The comparison of the different PCR methods showed that examination of identical tissues samples with different research methods can lead to different diagnosis. This study underlines the vales of the validation of the method, since the comparison of the PCR methods revealed large difference in sensitivity. The stress experiments showed, that infection with KHV can lead to latently infected virus carriers and that stress is able to induce a new virus excretion. In contrast to field observations, disease symptoms and mortalities seldomly occurred in the laboratory infection experiments. This study emphasises that the pathogenesis of the disease remains unexplained. The vaccination experiments also confirm this. No protection was obtained with killed-virus preparations.

Karpfenbestände wurden in der Vergangenheit häufig über den Zukauf von symptomlosen Virusträgern mit dem Koi Herpesvirus (KHV) infiziert. Das KHV verursacht bei Karpfen eine verlustreiche Erkrankung, die hohe wirtschaftliche Verluste nach sich zieht und die Versorgung der Bevölkerung mit Lebensmitteln tierischen Ursprungs beeinträchtigt. Besonders nach Streßsituationen, wie längeren Transporten, dem Umsetzen oder der Erkrankung an opportunistischen Krankheitserregern kam es in diesen Beständen zu einem Ausbruch der Erkrankung. Mit der vorliegenden Studie wurde geprüft, ob das Koi Herpesvirus wie es für Herpesviren typisch ist, in einer inaktiven Form über einen längeren Zeitraum im Organismus persistieren kann und es nach Stresssituationen oder einer Immunsuppression zu einer Virusreaktivierung kommen kann. Es wurde untersucht, ob eine gezielte Belastung von Koi nach natürlicher Infektion und Karpfen nach überstandener Laborinfektion eine Ausscheidung von infektiösem Virus zu induzieren oder zu erhöhen vermag, auch wenn bei diesen Fischen das Virus mittels molekularbiologischer Methoden nicht mehr nachgewiesen werden kann. Virusfrei aufgezogene Karpfen wurden im Labor durch Kohabitation mit einem an KHV erkrankten Koi infiziert, dann wurde die Temperatur für vier Wochen auf 30-32°C erhöht. Danach wurden die Fische weitere vier Wochen bei 23°C gehalten. Zu Versuchsbeginn erfolgte eine Kohabitation ohne die Einwirkung eines Stressors, um zu überprüfen, ob spontan infektionsfähiges Virus ausgeschieden wurde. Anschließend wurden die latent infizierten Virusträger mit einem simulierten Transport, einem simulierten Abfischen, einer Infektion mit dem Blutparasiten Trypanoplasma borreli, einer kortikosteroidinduzierten Immunsuppression und einer oralen Reinfektion mit dem KHV ausgesetzt und die Wirkung auf die Ausscheidung von infektiösem Virus durch Kohabitation mit naiven Karpfen und Untersuchung der Karpfen mittels PCR kontrolliert. Die Ergebnisse zeigten, dass Stresssituationen und eine Reinfektion mit dem KHV bei latent mit dem KHV infizierten Fischen zu einer Virusreaktivierung und Ausscheidung von infektiösem Virus führen können. Es war weitgehend ungeklärt, ob andere Fischarten ebenfalls unerkannt zu einer weiteren Verbreitung des Virus beitragen können. Dem KHV exponierte Graskarpfen, Schleien, Goldfische und Silberkarpfen wurden mit naiven Karpfen kohabitiert und mittels PCR untersucht. Bei allen untersuchten Fischarten ließ sich DNA des Koi Herpesvirus nachweisen, ebenso in Geweben von naiven Karpfen, die mit Fischen aus diesen Arten vergesellschaftet wurden. Es wurden Versuche zur Vakzinierung von Karpfen mit einer formalininaktivierten und einer hitzeinaktivierten Viruslösung durchgeführt. Weder über das Bad, noch bei intraperitonealer, rektaler oder oraler Applikation der Impflösungen konnte ein wirksamer Schutz vor einer Erkrankung an dem KHV aufgebaut werden. Da derzeit keine einheitliche PCR-Methode für den KHV-Nachweis in den verschiedenen Untersuchungseinrichtungen angewandt wird, sollte untersucht werden, ob die Untersuchung von Gewebeproben mit verschiedenen PCR-Methoden zu vergleichbaren Ergebnissen führt. Die aus Gewebeproben eines infizierten Goldfisches, eines infizierten Karpfens und von drei infizierten Koi mittels verschiedener Extraktionsmethoden gewonnene DNA wurde mit verschiedenen Kombinationen aus Primerpaaren und Polymerasen untersucht. Der Vergleich der verschiedenen PCR-Methoden zeigte, dass die Untersuchung identischer Organproben mit unterschiedlichen Untersuchungsmethoden zu unterschiedlichen Ergebnissen führen kann. Die Studie unterstreicht die Bedeutung der Validierung der Nachweismethode, da der Vergleich der PCR-Methoden große Unterschiede in der Sensitivität offenbarte. Die Stressversuche zeigten, dass es bei Infektionen mit dem Koi Herpesvirus zur Ausbildung von latent infizierten Virusträgern kommen kann und dass durch Stress eine erneute Virusausscheidung induziert werden kann. Die in den Versuchen nur unregelmäßig auftretenden Krankheitssymptome und Mortalitäten stehen im Gegensatz zu Feldbeobachtungen. Die Studie unterstreicht, dass die Pathogenese der Erkrankung weitgehend ungeklärt ist. Dieses zeigen auch die Vakzinierungsversuche. Mit abgetöteten Viruspräparationen ließ sich kein Schutz errreichen.

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Meyer, Kirsten: Untersuchungen zur Übertragung von Koi-Herpesvirus-Infektionen durch symptomlose Carrierfische. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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