Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Knorpelersatz beim Hund

Muschter, Nicole

Aim of this study was to examine the behavior of canine chondrocytes after cultural expansion and settlement on a beta- tricalciumphosphate-(ß-TCP)-matrix as well as their emigration behavior onto the matrix from a cartilage flake. First the chondrocytes were detached from caninen cartilage flakes with the aid of a mixed solution of collagenase NB 8 and medium 199 using a incubation time of approximately (approx.) six hours. After transfering the cells into a cell-culture-bottle, they were incubated in medium 199. The incubation time depended on advance of the expansion of the cells. At the completion of one half of a week to a week the cell-increase was high enough for detaching the chondrocytes with the aid of TrypsinLE (trypsin substitute) of the surface of the cell-culture-bottle producing a cell suspension with 100,000 cells per millilitres (ml). The Cerasorb®-construct (8.5 x 20 millimeters [mm]) used in this study consisted of phase-pure p-TCP with macro pits of approx. 1 mm of diameter. 1,5 ml of the cell suspension was given on five of these Cerasorb®-constructs and then these were incubated for approx. a week in medium 199. In a second experimental approach again five Cerasorb®-constructs were charged each with two caninen cartilage flakes of variable size and incubated also for a week in medium 199. The evaluation of the experiments occurred through cell coloring and picture giving procedures. For the definition of cell vitality the constructs were covered using 0,2 %igen Trypanbluesolution and then evaluated microscopically. Cells with blue colored cytoplasma were identified as dead. Living cells were made visible using fluorescence coloring with 4´.6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). The morphology of the cells on the constructs was evaluated using raster electrone microscopic investigation. The applied investigation methods showed in both groups (cell suspension and cartilage flake) living and dead cells of fibroblastoid type. In this study emigrating of cells on the construct could be proven for both methods of settlement. It was shown that the direct settlement on the constructs by means of cell suspension was superior to the method with cartilage flakes as well considering the growth rate as considering the spreading of cells on the construct. In conclusion the settlement of chondrocytes on a ß-TCP-construct is possible and the cells grow well on the constructs, therefore it seems to be possible to develop a cartilage bone substitute for clinical use. The growth behavior and the secretion of the the corresponding collagene and proteoglycane have to be investigated in further studies. With regard to the clinical use it is desirable to speed the settlement procedures up. Furthermore the transfection (e.g. with the aid of a HMGA 2-protein) of chondrocytes could be a promising method and will be investigated in a following study.

Ziel dieser Studie war es, das Verhalten caniner Chondrozyten nach kultureller Expansion und Besiedlung einer Beta-Tricalciumphosphat-(ß-TCP)-Matrix sowie deren Auswanderungsverhalten auf die Matrix aus einem Knorpelspan zu untersuchen. Dafür wurden zunächst die Chondrozyten mit Hilfe einer Mischlösung aus Collagenase NB 8 und Medium 199 und entsprechender Inkubationszeit von circa (ca.) sechs Stunden aus den caninen Knorpelspänen herausgelöst. Nach Überführung der Zellen in eine Zellkulturflasche wurden sie in Medium 199 inkubiert, die Dauer der Inkubation richtete sich nach dem Fortschreiten der Expansion. Nach Ablauf von einer halben bis einer Woche war die Zellvermehrung ausreichend weit fortgeschritten, so dass die Chondrozyten mit Hilfe von TrypsinLE (Trypsin-Ersatz) von der Oberfläche der Zellkulturflasche losgelöst und eine Zellsuspension mit 100000 Zellen pro Milliliter (ml) hergestellt werden konnte. Die verwendeten 8,5 x 20 Millimeter (mm) großen Cerasorb®-Zylinder bestanden aus phasenreinem ß-TCP mit Makroporen von ca. 1 mm Durchmesser. Insgesamt wurden fünf dieser Zylinder mit 1,5 ml der Zellsuspension beimpft und anschließend in Medium 199 für ca. eine Woche inkubiert. In einem zweiten Versuchsansatz wurden ebenfalls fünf Cerasorb®-Zylinder mit je zwei caninen Knorpelspänen variabler Größe beschickt und anschließend eine Woche in Medium 199 inkubiert. Die Auswertung der Versuchsreihen erfolgte durch Zellfärbung und bildgebende Verfahren. Für die  Bestimmung der Zellvitalität wurden die Zylinder mit einer 0,2 %igen Trypanblaulösung überschichtet und anschließend mikroskopisch ausgewertet. Zellen mit blau gefärbtem Zytoplasma konnten somit als abgestorben bzw. tot identifiziert werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzfärbung mit 4´,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) konnten lebende Zellen sichtbar gemacht werden. Die Bestimmung der Morphologie der Zellen auf den Konstrukten erfolgte durch die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung. Die angewandten Untersuchungsmethoden zeigten sowohl auf den mit der Zellsuspension besiedelten als auch auf den mit Knorpelspänen beschickten ß-TCP-Konstrukten lebende und tote Zellen fibroblastoiden Typs. Für beide Methoden der Besiedlung konnte somit in dieser Studie ein Auswandern von Zellen auf das Konstrukt nachgewiesen werden. Dabei war festzustellen, dass die direkte Besiedlung der Zylinder mittels Zellsuspension der Beimpfung mit Knorpelspänen sowohl hinsichtlich der Wachstumsgeschwindigkeit als auch der Ausbreitung der Zellen deutlich überlegen war. Für die Zielvorstellung, einen Knorpel-Knochen-Ersatz für die klinische Anwendung zu entwickeln, bleibt schlussendlich festzustellen, dass die Besiedlung einer ß-TCP-Keramik mit Chondrozyten grundsätzlich möglich ist und diese Matrix von den Zellen gut angenommen wird. Das weitere Wachstumsverhalten und die Sezernierung der entsprechenden Kollagene und Proteoglykane werden in folgenden Studien überprüft. Im Hinblick auf die klinische Anwendung sind die Besiedlungsverfahren wünschenswerterweise zu beschleunigen. Die Transfektion (z. B. mit Hilfe eine HMGA 2-Proteins) könnte ein erfolgversprechendes Verfahren sein und wird in einer folgenden Studie überprüft.

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Muschter, Nicole: Knorpelersatz beim Hund. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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