Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Ausscheidung von Lawsonia intracellularis mittels molekuarbiologischer Untersuchungsverfahren

Nathues, Heiko

Lawsonia (L.) intracellularis is the etiologic agent of porcine proliferative enteropathy that occurs widely spread in different forms and has a major economic impact on pig production worldwide. Diagnosis of infection is routinely based on ELISA and is increasingly done by PCR. The interpretation of laboratory results has become more difficult, even in herds in which the medical history and the vaccinal status of the investigated pigs is known, because only limited information is available about the direct and indirect detection of L. intracellularis in pigs, which have been vaccinated with Enterisol® Ileitis or treated with tylosin. The aim of this comparative study was to examine whether the results from molecular biology or serological testing were influenced by vaccination or antibiotic treatment of naturally exposed pigs. The first step was to implement and harmonize a multiplex-PCR in order to provide a rapid and sensitive simultaneous detection method for L. intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli in porcine faecal samples. Brachyspira species should always be excluded due to similar clinical signs. Analytical specificity and sensitivity were assessed by comparing sequences of PCR products to those of the reference strains and plasmidal DNA, respectively. The diagnostic specifity and sensitivity were evaluated by a double blinded testing of 105 samples with well known methods and the new multiplex PCR. The influence of vaccination and antibiotic treatment on diagnostic tests like PCR and ELISA was examined comparing results from vaccinated (n=150), tylosin treated (n=150) and untreated pigs (n=45). Animals were vaccinated aged 8 or 11 weeks, in order to detect a probable influence of time of treatment. In total, 1,150 faecal samples and 600 serum samples were obtained during the trial for the direct and indirect detection of L. intracellularis. Assessing the average daily weight gain of each pig enabled documentation to be made of the illness, because proliferative enteropathy would have an impact on this parameter. Sequences of PCR-products showed 96.68% homology to those of the reference strain of L. intracellularis. Comparison with type strain was even better showing 100% homology. The analytical sensitivity of the multiplex PCR is 103 copies/ml of material. The agreement between multiplex PCR and other methods was evaluated by Kappa-Index. Comparing results to those of uniplex or nested PCR agreement is substantial, whereas it is moderate to those of the immunofluorescence test. The influence of treatment on the shedding rate of L. intracellularis was observed in tylosin treated pigs only (p<0.0001). The frequency of detection of the agent was significantly reduced in those pigs, compared to vaccinated or untreated animals. Detection of L. intracellularis twice or more often has a significant negative impact on the average daily weight gain in vaccinated and untreated pigs (p<0.0001). Serological reaction, tested by Enterisol® Ileitis ELISA, was very similar in all treatment groups (p=0.8358). It was also seen that ELISA was not able to detect antibodies after vaccination. Seroconversion was observed delayed in all treatment groups after infection became apparent by PCR. Dynamics of serological reaction were neither influence by treatment nor by time of vaccination. As expected, the average daily weight gain was independent from ELISA results (p=0.7662). The results indicate rather no influence of vaccination with Enterisol® Ileitis on applied diagnostic tests. Therefore, repetitive detection of L. intracellularis by PCR might be a predictive parameter for clinical illness verbalised by suffering from proliferative enteropathy only in non-medicated or vaccinated pigs. In animals treated with tylosin this conclusion would be illegitimate.

Lawsonia (L.) intracellularis ist der Erreger der porzinen proliferativen Enteropathie, die beim Schwein weltweit in verschiedenen Ausprägungsformen vorkommt und mit erheblichen wirtschaftlichen Einbußen einhergeht. Der Nachweis der Infektion erfolgt üblicherweise mittels ELISA und in letzter Zeit zunehmend auch mit PCR Verfahren. Bei der Interpretation der Untersuchungsergebnisse ergeben sich aber häufig Unsicherheiten, da ein möglicher Einfluss der Impfung von Schweinen mit Enterisol® Ileitis resp. einer Behandlung mit Tylosin auf die Diagnostik bisher nicht untersucht und damit auch nicht auszuschließen war. Die vorliegende Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, den Einfluss der genannten Bekämpfungsmaßnahmen auf die Diagnostik zu bewerten. Dazu wurde zuerst eine multiplex PCR für die Untersuchung von Kotproben auf Genomfragmente von L. intracellularis entwickelt und etabliert. Mit dieser PCR kann gleichzeitig auch auf die differentialdiagnostisch zu berücksichtigenden Erreger Brachyspira hyodysenteriae und Brachyspira pilosicoli untersucht werden. Die analytische Spezifität der multiplex PCR wurde anhand der Untersuchung von Referenzstämmen und die analytische Sensitivität an Plasmid-DNA bestimmt. Die diagnostische Sensitivität und Spezifität wurde aus den Ergebnissen von 105 Proben abgeleitet, die in einer „doppel-blind“ Studie sowohl mit bereits etablierten Labormethoden als auch der multiplex PCR untersucht worden waren. Ein möglicher Einfluss der genannten Behandlungsmaßnahmen auf die Diagnostik mittels PCR und ELISA wurde vergleichend an geimpften Tieren (n = 150), mit Tylosin behandelten (n = 150) und unbehandelten Schweinen (n = 45) untersucht. Mit dem Ziel, auch einen eventuell vom Impfzeitpunkt abhängigen Einfluss feststellen zu können, wurden Schweine im Alter von 8 oder 11 Wochen geimpft. Für den direkten resp. indirekten Nachweis von L. intracellularis wurden insgesamt 1.150 Kotproben und 600 Serumproben entnommen. Als Parameter für die Ausprägung der proliferativen Enteropathie wurde der mittlere tägliche Zuwachs erfasst. Die mittlere Übereinstimmung zwischen den Nukleotidsequenzen der PCR-Produkte und der Sequenz des Referenzstamms von L. intracellularis betrug 96,68 %; das Alignment mit der Sequenz des Typstamms ergab allerdings eine Übereinstimmung von 100 %. Die analytische Sensitivität der multiplex PCR kann für L. intracellularis mit 103 Kopien/ml Ausgangsmaterial angegeben werden. Die Übereinstimmung der Ergebnisse, die mit der multiplex PCR und der uniplex resp. nested PCR zum Nachweis von L. intracellularis erzielt wurden, kann anhand des Kappa-Index mit „gut“ bewertet werden. Die Übereinstimmung zwischen multiplex PCR und Immunfluoreszenztest war dagegen „befriedigend“. Ein Einfluss der Behandlungsmaßnahmen auf die Erregerausscheidung konnte mittels multiplex PCR ausschließlich nach Verabreichung von Tylosin festgestellt werden (p <0,0001). Die Häufigkeit der Erregerausscheidung war bei den mit Tylosin behandelten Schweinen gegenüber den geimpften und unbehandelten Tieren signifikant reduziert. Der mehrmalige Nachweis einer Erregerausscheidung bei geimpften oder unbehandelten Schweinen ging außerdem einen negativen Effekt auf den täglichen Zuwachs einher (p <0,0001). Der, mittels Enterisol® Ileitis ELISA nachweisbare Verlauf der Seroreaktion war für alle Behandlungsgruppen annähernd gleich (p = 0,8358). Dabei konnte auch festgestellt werden, dass die Impfung keine nachweisbare Seroreaktion induziert. Eine Serokonversion war in allen Behandlungsgruppen erst im Zusammenhang mit der späteren Infektion nachzuweisen. Ein Einfluss der Behandlung, wie auch ein Einfluss des Impfzeitpunktes auf die ELISA-Diagnostik ist somit nicht erkennbar. Die ELISA Ergebnisse hatten erwartungsgemäß keinen Einfluss auf den Parameter „täglicher Zuwachs“ (p = 0,7662). Die Impfung von Schweinen mit Enterisol® Ileitis nimmt keinen nachweislichen Einfluss auf die PCR- und ELISA-Diagnostik. Daher kann ein wiederholter Nachweis von L. intracellularis bei unbehandelten und geimpften Tieren als Hinweis auf das Vorliegen einer porzinen proliferativen Enteropathie bewertet werden. Bei Schweinen, die mit Tylosin behandelt werden, ist diese Schlussfolgerung nicht zulässig.

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Nathues, Heiko: Untersuchungen zur Ausscheidung von Lawsonia intracellularis mittels molekuarbiologischer Untersuchungsverfahren. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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