Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Klinische Untersuchung zur prospektiven Klassifizierung subfertiler Stuten

Pansegrau, Ute

The aim of the present study was to find out how reproductive disorders in problem mares, with a disposition to persistent mating induced endometritis, are related to dysfunctional uterine contractile activity (UCA). Additionally, seminal plasma, given into the uterus after insemination, and oxytocin administered immediately after insemination, were tested on their stimulating effects on uterine contractions and positive influence on pregnancy rates. Also the influence of UCA on uterine bacteriological and cytological findings before and after insemination was examined. Sixtytwo warmblood mares (age 4 to 21) were examined in 94 cycles. Fifty subfertile, barren mares were examined in 82 cycles and randomly asigned into three experimental groups: oxytocin (n = 27 mares, 20 IU oxytocin after insemination),  additional seminal plasma (n = 25 mares, 20 ml seminal plasma from a deep frozen seminal plasma pool) or left untreated (n = 30). 12 mares with foal served as fertile control. All mares were inseminated twice with fresh semen (500 x 106 spermatozoa in 12 ml insemination volume) of one of two fertile stallions. The spontaneously cycling mares were treated with 2500 IU hCG when the dominant follicle had reached a diameter of at least 35 mm, and were inseminated into the uterine body at 24 and 48 h after hCG-administration. Uterine contractile activity was evaluated by transrectal B-mode ultrasonograpy (100 Falco, Pie Medical, linear probe, 6 MHz) 16-18 days after last oestrus, immediately before and after the first and second insemination and 48 h after the second insemination within the end of the physiological uterine clearance. The ultrasound probe was fixed in a transverse position over the uterine horn ipsilatarally to the dominant/ovulated follicle. In each case uterine contractions werde recorded over periods of 5 minutes, respectively, and for a 10 minutes period after the first insemination. The strength of uterine contractile activity was documented in a score level system (0 = no contractions to IV = very strong contractions). For further comparison between the groups uterine biopsies were taken 16 to 18 days after last oestrus before insemination and bacteriological and cytological swabs of the uterus were obtained before the first and 48 h after the second insemination. Additionally, first experiments were performed in order to investigate if oxytocin administration immediately after insemination can result in precocious elimination of spermatozoa from the mare’s genital tract.   The following results were obtained: 1. There are significant differences in the uterine contractile activity of all mares between the different times of evaluation. These significant differences were between uterine contractions 16 to 18 days after last oestrus and all other times evaluated (P < 0.002), between UCA before first and second and after first and second insemination (P < 0.0001), and between UCA after insemination and 48 h after second insemination (P < 0.0001). Also after second insemination there was a highly significant stronger UCA than after the first insemination, but score levels before insemination stayed nearly the same.   2. In comparison of the 4 treatment groups, the control group showed in general stronger uterine contractions. Significant differences between the groups in the UCA were shown at 16 to 18 days after last oestrus between the control group and all other groups ( P < 0.02), and after the first insemination between the control and the oxytocin treated mares on the one side and the seminal plasma and untreated mares on the other side (P < 0.0001). After the second insemination the oxytocin group showed significantly stronger uterine contractions than the seminal plasma and the untreated group (P < 0.05), while the control group had only significantly stronger contractions than the untreated group (P < 0.05). The UCA between the seminal plasma and the untreated group differed at no time significantly.   3. Despite the stronger uterine contractions in the oxytocin treated group, there was no indication that 20 IU of oxytocin injected immediately after insemination resulted in precocious sperm elimination. Also they never exceeded the contractions in the control group.   4. A positive correlation was shown between UCA and pregnancy results, while there was no relationship between UCA and the results of the bacteriological and cytological samples of the endometrium.   5. The comparison of the two bacteriological and cytological samples obtained prior to the first and 48 h after the second insemination showed no significant differences. Prior to first breeding 54 % of the bacteriological and 47 % of the cytological samples were negative, and 48 h after second insemination 56 % of the bacteriological and 64 % of the cytological swabs showed negative results. Comparison of the treatment groups showed significantly less positive bacteriological samples 48 h after the second insemination in the oxytocin group than in the seminal plasma treated group (P = 0.02). In all groups cytological findings showed lower numbers of polymorphonuclear neutrophils 48 h after second insemination than cytological samples before the first breeding. The same was true for bacteriological findings, except for the seminal plasma group. In addition there was a significant (P < 0.0001) relationship between the results of the cytological sample obtained 48 h after the second insemination and the pregnancy results. 79 % of the not-pregnant classified mares showed positive uterine cytological samples 48 h after insemination, while 60 % of the pregnant mares had negative cytological samples 48 h after breeding.   6. Results also showed that biopsy samples and saison had no influence on pregnancy results in this study. Significantly more younger than older mares got pregnant (P < 0.05).   7. Pregnancy rates differed significantly (P < 0.05) between the control group (83 %) and the 3 experimental groups (40 %).   The study showed that the uterine contractile activity is stimulated following artificial insemination, and that consecutive inseminations lead to even stronger uterine contractions. Subfertile, barren mares showed a lower UCA than fertile mares did. The UCA in these barren mares could be enhanced by oxytocin but not by seminal plasma. Despite the low pregnancy rates in the oxytocin-treated mares, the experiment showed, that oxytocin-administration after insemination did not cause precocious elimination of spermatozoa from the mare’s uterus.  Because of the positive correlation between UCA and pregnancy rate, poor uterine contractions could be seen as one major cause of subfertility in mares. For obtaining good pregnancy results, also negative cytological swabs 48 h after insemination were important, since mares with positive results at this time had a minor chance of getting pregnant. Therefore optimal insemination frequency and way and time of uterine sampling should be discussed in mare breeding management.

Ziel der Untersuchung war es, herauszufinden, inwiefern sich Reproduktionsstörungen bei Problemstuten, die zu besamungsinduzierter Endometritis neigen, auf eine gestörte Kontraktionsaktivität der Gebärmutter zurückführen lassen. Zusätzlich sollte überprüft werden, ob mit Seminalplasma eine ähnliche kontraktionsstimulierende Wirkung wie mit Oxytocin erreicht werden kann, und ob sich diese Behandlung direkt post inseminationem positiv auf die Trächtigkeitsrate auswirkt. Des weiteren wurde untersucht, ob die Uteruskontraktionsaktivität die uterinen mikrobiologischen und zytologischen Befunde prae und post inseminationem beeinflusst, und ob Beziehungen zum Entstehen einer Gravidität bestehen.   Für die Studie standen 62 Warmblutstuten (4 bis 21 Jahre) zur Verfügung, die in 94 Zyklen untersucht wurden. Dabei entfielen 12 Stuten mit Fohlen bei Fuß auf die fertile Kontrollgruppe. Die restlichen 50 Stuten, die in der letzten Decksaison güst geblieben waren, wurden in insgesamt 82 Zyklen untersucht, zufällig auf die drei Versuchsgruppen: Oxytocin (n = 27), Seminalplasma (n = 25) und unbehandelt (n = 30) aufgeteilt und mit  Frischsamen zweier fertiler Hengste besamt (Besamungsdosis 500 x 106 vorwärtsbeweglicheSpermien in 12 ml Inseminatvolumen). Dazu wurde die Ovulation bei ultrasonographischem Nachweis eines Follikels von mindestens 35 mm Durchmesser durch die intravenöse Gabe von 2500 IE hCG induziert, und alle Stuten 24 und 48 h nach hCG-Gabe in das Corpus uteri besamt. Je nach Versuchsgruppe wurde den Stuten direkt nach der Besamung 20 IE Oxytocin injiziert, 20 ml Seminalplasma aus einem Seminalplasmapool intrauterin verabreicht oder sie blieben unbehandelt. Die uterine Kontraktionsaktivität wurde mittels transrektaler Ultrasonographie am Tag 16-18 nach der letzten Rosse (KA1), direkt vor und nach der ersten (KA2 und KA3a/b) und zweiten Insemination (KA4 und KA5), sowie 48 h nach der zweiten Besamung zum Ende der uterinen Clearance (KA6) bestimmt. Dazu wurde die Ultraschallsonde (Linearschallkopf, 6,0 MHz) quer über das Uterushorn ipsilateral zum dominaten/ovulierten Follikel positioniert und die Gebärmutterkontraktionen über 5, bzw. 10 Minuten nach der ersten Besamung, erfasst. Die Auswertung der Kontraktionsaktivität erfolgte mit Hilfe eines Scoresystems von 0 (keine Kontraktionen) bis IV (sehr starke Kontraktionen). Zusätzlich wurde von allen Stuten bei der Eingangsuntersuchung ein Endometriumsbioptat gewonnen, sowie vor der ersten und 48 h nach der zweiten Besamung Uterustupferproben für eine mikrobiologische und zytologische Auswertung genommen. Außerdem wurde mittels einer Uteruslavage, die 2 h nach Insemination durchgeführt wurde, untersucht, inwiefern Oxytocin, direkt postinseminatorisch verabreicht, einen Einfluss auf eine eventuell vorzeitige Elimination der Spermien aus der Gebärmutter hat.   Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet: 1. Ein Vergleich der mittleren uterinen Kontraktionsaktivität aller Stuten (n = 94) ergab deutliche Unterschiede zwischen fast allen Messzeitpunkten. So zeigten sich signifikante Unterschiede (P < 0,002) zwischen KA1 (16-18 Tage nach der letzten Rosse) und allen anderen Messzeitpunkten, zwischen den Uteruskontraktionen vor (KA2 und KA4) und nach (KA3a/b und KA5) der Insemination (P < 0,0001), sowie zwischen der Uterusmotilität nach der Besamung (KA3a/b und KA5) und 48 nach der zweiten Besamung (KA6) (P < 0,0001). Nach der zweiten Insemination war zusätzlich eine hochsignifikant stärkere uterine Kontraktionsaktivität (P < 0,0001) zu verzeichnen als nach der ersten Besamung, während direkt vor den Samenübertragungen nahezu identische Aktivitätsniveaus auffielen.   2. Vergleicht man die Kontraktionsaktivität zwischen den Gruppen, so zeigte die Kontrollgruppe ein allgemein höheres Aktivitätsniveau. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ließen sich zum Zeitpunkt KA1 zwischen der Kontrollgruppe und allen Versuchsgruppen (P < 0,02), zum Messzeitpunkt KA3b nach der ersten Besamung zwischen der Oxytocin- und Kontrollgruppe auf der einen Seite und der Seminalplasma- und der unbehandelten Gruppe auf der anderen Seite (P < 0,02) darstellen. Nach der zweiten Insemination zeigte die Oxytocingruppe signifikant stärkere uterine Kontraktionen als die Seminalplasma- und die unbehandelte Gruppe (P < 0,05), die Kontrollgruppe  aber nur noch gegenüber der unbehandelt gebliebenen Gruppe (P < 0,05). Die Kontraktionsaktivität der Gebärmutter in der Seminalplasma- und der unbehandelten Gruppe unterschied sich zu keinen Zeitpunkt signifikant voneinander.   3. Trotz der verstärkten Uteruskontraktionen bei der mit Oxytocin behandelten Gruppe, die jedoch nicht über das Kontrollniveau hinausging, gab es keine Hinweise darauf, dass Oxytocin, in einer Menge von 20 IE post inseminationem verabreicht, einen frühzeitigen Rückfluss des Inseminats aus dem Uterus bedingte.   4. Zwischen der Uteruskontraktionsaktivität und dem Trächtigkeitsergebnis konnte ein positiver Zusammenhang gezeigt werden. Es konnte aber kein Zusammenhang zwischen der Uterusmotilität und den Ergebnissen der mikrobiologischen und zytologischen Untersuchung der Gebärmutter gebildet werden.   5. Beim Vergleich der zu den zwei Probezeitpunkten (BU1 und ZYTO1 vor der ersten Besamung und BU2 und ZYTO2 48 h nach der zweiten Besamung) gewonnenen bakteriologischen und zytologischen Ergebnissen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Zum Zeitpunkt 1 waren  54 % der bakteriologischen und 47 % der zytologischen Proben, zum Zeitpunkt 2 56% der bakteriologischen und 64 % der zytologischen Proben negativ. Beim Behandlungsgruppenvergleich zeigten sich signifikant weniger positive Proben bei BU2 (P = 0,02) bei der Oxytocin- als bei der Seminalplasmagruppe. Insgesamt ließen sich bei allen Gruppen 48 h nach der zweiten Insemination weniger positive zytologischen Proben als vor der ersten Besamung feststellen. Gleiches galt auch für die positiven mikrobiologischen Proben, mit Ausnahme bei der mit Seminalplasma behandelten Gruppe. Außerdem konnte ein signifikanter Zusammenhang (P < 0,0001) zwischen der 48 h nach der Besamung erhobenen zytologischen Probe und dem Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung hergestellt werden. Bei 79 % der nicht tragenden Stuten konnten 48 h nach der zweiten Besamung Leukozyten im Uterus nachgewiesen werden, und 60 % der Stuten mit positivem Befruchtungsergebnis hatten 48 h nach der zweiten Besamung eine negative Zytologie.   6. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass das Biopsieergebnis, sowie die Saison keinen Einfluss auf das Trächtigkeitsergebnis hatten. Jüngere Stuten wurden aber signifikant           (P < 0,05) besser tragend als ältere Stuten.   7. Das Ergebnis der Trächtigkeitsuntersuchung unterschied sich signifikant (P < 0,05) zwischen der Kontrollgruppe (83 %) und den Versuchsgruppen (40 %).   Die Untersuchungen verdeutlichen, dass die Uteruskontraktionsaktiviät durch die Besamung angeregt wird und sich bei aufeinanderfolgenden Besamungen noch signifikant steigert. Insgesamt ist bei subfertilen Stuten eine schwächere Myometriumsaktivität feststellbar als bei fertilen Tieren. Die Uteruskontraktionsaktivität ließ sich mit Hilfe von Oxytocin, nicht aber mit zusätzlich intrauterin verabreichtem Seminalplasma steigern. Die niedrige Trächtigkeitsrate in der Oxytocingruppe konnte nicht mit einer vorzeitigen Elimination der Spermien aus der Gebärmutter aufgrund einer direkt postinseminatorisch verabreichten Oxytocininjektion in Zusammenhang gebracht werden. Da ein positiver Zusammenhang zwischen der Kontraktionsaktivität und dem Trächtigkeitssergebnis festgestellt werden konnte, ist eine verringerte uterine Aktivität als eine Ursache von suboptimaler Fertilität bei Stuten zu sehen. Hinsichtlich eines positiven Trächtigkeitsergebnisses war auch der Nachweis von PMNs im Uterus 48 h nach der Besamung von Bedeutung. Stuten mit einem positiven zytologischen Tupfer zu diesem Zeitpunkt hatten die geringsten Trächtigkeitschancen. Daher sollte über eine optimale Besamungsfrequenz und die Art und den Zeitpunkt der Probennahme aus der Gebärmutter nachgedacht werden.

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Pansegrau, Ute: Klinische Untersuchung zur prospektiven Klassifizierung subfertiler Stuten. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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