Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Peripartale Expression von Toll-like-Rezeptoren und [beta]-Defensinen im Endometrium des Rindes

Petzl, Nadine

Endometritis is one of the economically most relevant diseases in dairy cows. However, there is still a lack in proper therapeutic and prophylactic concepts. This study helps to illuminate the periparturient mechanisms and factors that are involved in endometritis pathogenesis. The main focus is on early pathogen-host interactions within the bovine Endometrium. Within that special point of interest the expression of Toll-like receptors (TLRs) and antibacterial effector molecules (β-defensins) were being investigated using quantitative real-time PCR. A main part of the present study was the development of an animal model that reflected the different peripartal stages (shortly before parturition, in parturition and shortly after parturition) and made it possible to analyse the TLR and β-defensin expression and their changes during the dynamic periparturient period. We found that the dynamic changes of the estrogen levels and even more the decreasing progesterone levels were reflected within the three animal groups (A, B C). All analyzed TLRs (TLR2, TLR3, TLR4, TLR6 and TLR9) as well as the β-defensins BNBD5 and universal defensin (uDef) have been expressed throughout the whole investigated period in both caruncular endometrium and intercaruncular endometrium. These two endometrial surfaces with potential microbial contact post partum (p.p.) were closer being examined. It was shown that the immunological capacity differed between the groups as well as between the two endometrial sites. These differences in parameter expression appeared to be dependent on the time of tissue sampling (groups A, B and C) and could also be seen 24h to 30h later. The expression of both, defensins and TLRs was enhanced in the caruncular endometrium compared with the intercaruncular endometrium already 4 to 6 h p.p. Moreover, animal groups showed considerable variation: Within 24 to 30 h p.p. in group C (compared to B), all genes were generally stronger being expressed. In group B this applied only to the caruncular endometrium and expression of most TLRs and β-defensins were even decreased in this group. In a second part of the investigation it was shown that the naturally occurring bacterial contamination p.p. had an impact on TLR and β-defensin expression in the bovine endometrium. Depending on the bacterial contamination, differences in TLR and β-defensin gene expression showed up between animal groups and tissues. For instance, only in the caruncular endometrium of animals with spontaneous births an increased expression was already noted in the early phase of infection (after 4 to 6 hours). This was also seen after 24 to 30 hours of infection in the intercaruncular endometrium, but only in group C animals. Throughout the study a special role of TLR9 could be observed. In contrast to other genes, this receptor appeared not to be regulated in the peripartum or after bacterial uterine infection. In the third part of the study, peripheral and local sexual steroid hormone levels were correlated with each other as well as with TLR and defensin expression. In group A, the plasma estrogen levels were higher in local versus peripheral blood vessels, these differences were significant in group B. Progesterone levels followed in group A an inverse pattern. However, individually different hormone concentrations had no impact on the expression levels of TLRs and β-defensins. During the whole trial TLR and β-defensin expression differences between intercaruncular and caruncular endometrium in the peripartum were evident. This indicates a different immuno-modulatory function of these tissues in cattle. The initial data obtained with the established peripartal animal model allow estimating the importance of pathogen recognition receptors for early host-pathogen interaction in the uterus. This opens new possibilities of further investigations on peripartal defence mechanisms and will open new ways to influence the periparturient immune response to invading pathogens and the resistance to endometritis in post partum cows. In the long run new concepts for the treatment and prophylaxis of endometritis should be developed as well as the identification of new candidate genes for the breeding of animals with enhanced immune functions..

Die Endometritis ist eine der wirtschaftlich bedeutendsten Erkrankungen in der Rinderhaltung, für die es bisher nur unbefriedigende Prophylaxe- und Therapiekonzepte gibt. Als Teil eines wissenschaftlichen Gesamtkonzeptes trägt die vorliegende Arbeit dazu bei, Mechanismen aufzuklären, die peripartal an der Pathogenese der Endometritis beteiligt sind. Dabei stehen Ereignisse und Mechanismen im Mittelpunkt des Interesses, die in der frühen Phase der Erreger-Wirts-Interaktionen eine Rolle spielen. In diesem Projekt wurde insbesondere die endometriale Expression von Erregererkennungsrezeptoren (Toll-like-Rezeptoren, TLRs) und mikrobizider Effektormoleküle (β-Defensine) mittels quantitativer Real-Time-PCR untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Konzept entwickelt, das es ermöglichte, mit drei peripartalen Tiergruppen den unmittelbaren Zeitraum um die Geburt in der TLR- und β-Defensingen-Expression zu verfolgen. Dabei spiegelten sich die starken hormonellen Veränderungen in der Zeit von etwa 3 Tagen vor der Geburt bis 24 Stunden (h) post partum (p.p.) in den drei Versuchsgruppen (A, B, C) wieder. Die drei Gruppen setzten sich im Einzelnen aus präpartalen Tieren (Gruppe A), Tieren in Geburt (Gruppe B) und unmittelbar postpartalen Tieren (Gruppe C) zusammen. Alle untersuchten TLR- (TLR2, TLR3, TLR4, TLR6 und TLR9) sowie die β-Defensingene BNBD5 und uDef werden zu allen drei Zeitpunkten im Endometrium exprimiert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die beiden endometrialen Oberflächen, das Endometrium der Karunkeln (KE) und das interkarunkuläre Endometrium (IE), sich in ihrer immunologischen Reaktionsfähigkeit peripartal deutlich unterscheiden können. Dies war abhängig vom Zeitpunkt der peripartalen Probennahme (Gruppen A, B und C). Dieser Unterschied setzte sich auch 24 bis 30 h später fort. So konnte beobachtet werden, dass im karunkulären Endometrium, anders als im interkarunkulären Endometrium, bereits unmittelbar nach der Geburt in Gruppe C eine höhere Expressionsdichte untersuchter TLRs und Defensine zu verzeichnen war und dass die untersuchten Gruppen sich bezüglich der Expressionsänderung der TLR- und β-Defensingene innerhalb der ersten 24 bis 30 h p.p. in den beiden untersuchten Geweben unterschiedlich verhalten. Dabei wurden in der Gruppe C die untersuchten Parameter generell in der Expression verstärkt, während dies in der Gruppe B nicht zu beobachten war. In der Gruppe B konnte nur eine Verstärkung der TLR- und β-Defensingen-Expression im KE ermittelt werden. Im IE wurde ein Großteil der TLRs und BNBD5 in der Expression vermindert. Postpartal konnte jeweils eine bakterielle Kontamination des bovinen Uterus festgestellt werden. Dabei zeigte sich zumeist eine Kontamination mit einem Mischspektrum an Keimen. Abhängig von der bakteriellen Kontamination wurden Unterschiede in der Genexpression der TLRs zwischen den Gruppen und Geweben je nach Zeitraum der Kontamination festgestellt. So zeigte sich nur im KE eine Steigerung der TLR- und β-Defensingen-Expression bereits in der frühen Phase der Kontamination (nach 4 bis 6 Stunden p.p.). Dies war nach 24- bis 30-stündiger Kontamination auch im IE zu beobachten. Während der gesamten Studie konnte eine Sonderrolle von TLR9 ermittelt werden. Im Gegensatz zu den anderen untersuchten Genen unterlag dieser Rezeptor in der peripartalen Phase oder nach bakterieller uteriner Infektion keiner Regulation. In einem weiteren Projektabschnitt wurden periphere sowie lokal auf den Uterus einwirkende Sexualsteroidhormonkonzentrationen und ihr Zusammenhang mit der TLR- und β-Defensingen-Expression untersucht. In der Gruppe A erwiesen sich die Plasmaöstrogenspiegel in lokalen Blutgefäßen als tendenziell höher als in peripheren Blutgefäßen, in der Gruppe B waren diese Unterschiede signifikant. Bei den Progesteronkonzentrationen war dies nicht zu sehen. Interindividuell unterschiedliche Hormonkonzentrationen hatten auf die TLR- und β-Defensingen-Expression jedoch keinen Einfluss. Im gesamten Versuchsverlauf konnten Unterschiede zwischen interkarunkulärem und karunkulären Endometrium in Bezug auf TLR- und β-Defensingen-Expression sowie –Modulation im peripartalen Zeitraum gezeigt werden, was auf eine unterschiedliche Bedeutung dieser beiden Gewebe bezügliche ihrer immunmodulatorischen Funktion in der Gebärmutter des Rindes hinweist. Mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit erstellten peripartalen Tiermodells wurden orientierende Daten zur Einschätzung der Bedeutung von Erreger-Erkennungs-Rezeptoren für frühe Erreger-Wirts-Interaktionen im Uterus erlangt. Nach Erweiterung des Untersuchungsspektrums steht damit ein Instrument zur Verfügung, das zur Klärung einer ganzen Reihe spezifischer Fragestellungen zu peripartalen Abwehrprozessen im Uterus und damit zur Pathogenese der Endometritis eingesetzt werden kann. Erworbene Erkenntnisse dienen der Definition einer optimalen Abwehrlage im bovinen peripartalen Uterus. Langfristig sollen neue Ansätze für eine befriedigende Endometritisbehandlung und Prophylaxe erarbeitet sowie neue Kandidatengene für die Zucht von Kühen mit verbessertem Immunschutz identifiziert und funktionell validiert werden.

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Petzl, Nadine: Peripartale Expression von Toll-like-Rezeptoren und [beta]-Defensinen im Endometrium des Rindes. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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