Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Herstellung artifizieller antigenpräsentierender Zellen zur adoptiven Immuntherapie bei Tumorpatienten

Obermann, Sonja

The adoptive immunotherapy represents a promising approach for the treatment of recently incurable diseases. It includes the selection and expansion of effector cells in vitro as well as their infusion back into the patient. The aim of this therapy is the induction and / or enhancement of an antigen-specific immune response in vivo. Successful immunotherapy depends on the generation of an optimal lymphocyte population. The current “gold standard” to expand antigen-specific cytotoxic T cells (CTLs) entails generating autologous monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) out of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The use of MoDCs is limited by a lot of factors like complexity, expenses and variations. Therefore, new strategies were developed to generate antigen-specific T cells with high affinity. In this context, artificial antigen-presenting cells (aAPCs) turned out to be a possible alternative. This thesis deals with the development of a new cell-based aAPC, carrying a peptide-b2-microglobulin-MHC fusion construct (peptide-SC) on the surface. This peptide-SC construct represents a recombinant MHC class I molecule in which the b2-microglobulin as well as the peptide of interest are covalently coupled to the a-chain of HLA-A2. Performing a defined and reproducible cloning strategy enabled the synthesis of different peptide-SC constructs, which could be successfully transfected into MHC class I-negative tumor cell lines. By this strategy the expression of endogenously processed peptides and therefore the generation of alloreactive CTLs should be inhibited. Daudi cells were chosen as cell system. Beside their MHC class I-deficiency they express costimulatory molecules on their surface. This expression could be modulated by stimulation with CD40 ligand, lipopolysaccharide and interleukin (IL)-4. Additionally, transfected MHC class I-negative K562 cells were included in some studies. In this report, peptide-SC aAPCs presenting the model antigen M158-66 (M1-SC) or the tumour associated antigens AFP542-550 (AFP-SC) and NY-ESO-1495-503 (NY-ESO-SC) were constructed, respectively. They were used to generate antigen-specific CTLs out of PBMCs. Expanded T effector cells were checked for their specifity, functionality and avidity in vitro as well as in vivo. The stimulatory capacity of the constructed aAPCs was also compared with that of autologous MoDCs. M1-SC-transfected Daudi cells (Daudi M1-SC) enabled the rapid generation of high numbers M1-specific T cells out of PBMCs from healthy persons as wells as immunocompromised cancer patients. These effector cells showed high affinity and were able to recognize the M1 peptide on the surface of target cells, regardless whether it was loaded exogenously onto MHC class I molecules, intracellulary processed or presented by recombinant peptide-SC constructs. Besides, they displayed functionality in terms of proliferation, cytokine secretion and cytotoxicity. The stimulatory capacity of Daudi M1-SC cells was comparable to autologous MoDCs. The advantage of Daudi M1-SC-Zellen was their ability to stimulate and expand cultured cells over a longer time period. However, beside M1-specific T cells other cell populations could be detected in the mixed cell culture. They induced unspecific reactions in different functional assays. Additionally, they reduced the efficiency of Daudi M1-SC to expand antigen-specific CD8+ T cells in vitro. Daudi cells are able to induce the proliferation of g:d T cells by expressing distinct heat shock proteins on their surface. Based on this fact g:d T cells were considered as possible candidates. This supposition could be proven by flow cytometric analysis. M1-specific CTLs which were generated by Daudi M1-SC cells showed only limited functionality in vivo.  Next to Daudi M1-SC cells transfected K562 cells were also able to stimulate M1-specific effector cells ex vivo. However a long-term expansion was not successful, perhaps because of missing costimulatory molecules on their surface. The generation of AFP- and NY-ESO-reactive CTLs out of patients with hepatocellular carcinoma could be shown in two cases but the percentage of tumour-reactive effector T cells was relative low. The avidity and functionality of these cells was not checked and should be performed in following experiments. Additionally, it should be attempted to further increase the efficiency of the generated aAPCs by optimizing the culture conditions like stimulation of isolated CD8+ T cells, addition of IL-7 and / or IL-15 to the cell culture and introduction of different costimulatory molecules.  

Die adoptive T-Zelltherapie stellt einen viel versprechenden Ansatz dar, bisher unheilbare Krankheiten zu behandeln. Sie beinhaltet die Selektion und Expansion von Effektorzellen in vitro sowie deren Transfer zurück in den Patienten. Ziel dieser Therapieform ist es, eine antigenspezifische Immunantwort in vivo zu initiieren bzw. zu verstärken. Grundvoraussetzung für einen erfolgreichen, adoptiven T-Zelltransfer stellt die Generierung einer optimalen Lymphozytenpopulation dar. Der derzeitige „Goldstandard“ für die Expansion antigenspezifischer, zytotoxischer T-Zellen (CTLs) beinhaltet den Einsatz autologer MoDCs (dendritische Zellen, die aus Monozyten des Patienten generiert werden). Da diese Methode zahlreiche, limitierende Faktoren, wie z.B. aufwendige und kostenintensive Herstellung sowie hohe Variationen aufweist, wurden neue Strategien zur Generierung hochaffiner, antigenspezifischer T-Zellen entwickelt. Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) haben sich in diesem Zusammenhang als mögliche Alternative herausgestellt. In dieser Arbeit wird über die Entwicklung zellbasierter aAPCs berichtet, die das Peptid-b2-Mikroglobulin-MHC-Fusionskonstrukt (Peptid-SC) an ihrer Oberfläche präsentieren. Hierbei handelt es sich um ein rekombinantes MHC-Klasse-I-Molekül, bei dem sowohl das b2-Mikroglobulin als auch das jeweilige Peptid kovalent mit der schweren a-Kette des HLA-A2-Moleküls verbunden sind. Die Durchführung einer einfachen Klonierungsstrategie ermöglichte die Synthese verschiedener Peptid-SC-Konstrukte, die erfolgreich in MHC-Klasse-I-negative Tumorzelllinien transfiziert werden konnten. Hierdurch sollte eine Expression endogen prozessierter Peptide und somit eine Generierung alloreaktiver CTLs verhindert werden. Als Zellsystem wurden Daudi-Zellen ausgewählt. Neben einer MHC-Klasse-I-Defizienz weisen sie klassische, kostimulatorische Moleküle auf ihrer Oberfläche auf. Durch Aktivierung mit CD40-Ligand, Lipopolysaccharid und Interleukin (IL)-4 konnte dessen Expressionshöhe moduliert werden. Zusätzlich wurden MHC-Klasse-I-negative K562-Zellen in einige Studien miteinbezogen. Es wurden Peptid-SC-aAPCs hergestellt, die entweder das Modellpeptid Influenza M158-66 (M1-SC) oder die tumorassoziierten Antigene AFP542-550 (AFP-SC) bzw. NY-ESO-1495-503 (NY-ESO-SC) an ihrer Oberfläche exprimierten. Diese aAPCs wurden dazu verwendet, antigenspezifische CTLs aus mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) zu generieren. Anschließend erfolgte die Überprüfung der T-Effektorzellen auf Spezifität, Funktionalität und Avidität in vitro und in vivo. Die stimulatorische Kapazität der aAPCs wurde zudem mit der autologer MoDCs verglichen. Mit Hilfe von M1-SC-transfizierten Daudi-Zellen (Daudi M1-SC) war es möglich, innerhalb kurzer Zeit eine hohe Anzahl hochaffiner, M1-spezifischer T-Zellen aus PBMCs gesunder sowie krebskranker, immunsupprimierter Personen zu generieren. Diese CTLs waren in der Lage, das M1-Peptid an der Oberfläche von Targetzellen zu erkennen, unabhängig davon, ob es exogen an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden, intrazellulär prozessiert oder über rekombinante Peptid-SC-Konstrukte präsentiert wurde. Sie wiesen zudem Funktionalität in Form von Proliferation, Zytokinsekretion und Zytotoxizität auf. Die stimulatorische Kapazität der Daudi M1-SC-Zellen war mit der von autologen MoDCs vergleichbar. Daudi M1-SC-Zellen wiesen den Vorteil auf, dass sie die in Kultur befindlichen Zellen über einen sehr langen Zeitraum stimulieren und expandieren konnten. Allerdings konnte auch gezeigt werden, dass neben den M1-spezifischen T-Zellen ebenfalls andere Effektorzellen in der gemischten Zellpopulation vorhanden waren. Diese führten in verschiedenen funktionellen Testverfahren zu unspezifischen Reaktionen. Zusätzlich reduzierten sie die Effizienz der Daudi M1-SC-Zellen, antigenspezifische CD8+ T-Zellen in vitro zu expandieren. Basierend auf der Tatsache, dass Daudi-Zellen durch Expression bestimmter Hitzeschockproteine g:d T-Zellen zur Proliferation anregen können, wurden diese Zellen als mögliche Kandidaten in Betracht gezogen. Diese Vermutung konnte mittels durchflusszytometrischer Analysen bestätigt werden. Eine in vivo-Funktionalität M1-spezifischer CTLs, die mit Hilfe von Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden, konnte nur eingeschränkt nachgewiesen werden. Transfizierte K562-Zellen waren ebenfalls in der Lage, M1-spezifische Effektor-T-Zellen ex vivo zu stimulieren. Eine Langzeitexpansion war allerdings nicht erfolgreich, was vermutlich auf das Fehlen klassischer, kostimulatorischer Moleküle zurückzuführen ist. Die Generierung AFP- bzw. NY-ESO-1-reaktiver CTLs aus PBMCs von Patienten mit hepatozellulärem Karzinom mit Hilfe von Daudi Peptid-SC-Zellen wurde anhand zweier Beispiele gezeigt. Allerdings wies nur ein sehr geringer Prozentsatz Spezifität gegenüber dem entsprechenden, tumorassoziierten Antigen auf. Die Avidität und Funktionalität dieser Zellen wurde nicht überprüft und sollte in weiteren Analysen erfolgen. Außerdem sollte versucht werden, durch Optimierung der Kulturbedingungen, wie zum Beispiel einer Aufreinigung CD8+ T-Zellen vor ihrem Einsatz, Zugabe von IL-7 und IL-15 zur Zellkultur und Einführung zusätzlicher, kostimulatorischer Moleküle, die Effizienz der generierten aAPCs noch weiter zu erhöhen.

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Obermann, Sonja: Herstellung artifizieller antigenpräsentierender Zellen zur adoptiven Immuntherapie bei Tumorpatienten. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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