Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur möglichen Funktion der zytosolischen Carboanhydrase III in oxidativen, langsam kontrahierenden Muskelfasern der Maus

Reupke, Nils

Carbonic anhydrase (CA) III is a cytosolic isoenzyme, which is found in red, oxidative and slow-twitch muscle fibres (type 1) as well as in fat and liver cells. In this study, the possible function of CA III in type 1-muscle fibres should be investigated. For this purpose, isolated and intact muscle fibre bundles of the M. soleus from CA III Knockout (KO)-mice and from wild type sibling (WT) littermates were used. These muscles bundles were directly stimulated with pulses of 1 ms duration and supramaximal voltage. Isometric single twitches were recorded. A tetanus was triggered by a series of pulses of 1 ms and 100 V, with a frequency of 50 Hz and a duration of 1,5 s. The fatigue behaviour was analysed by a 40 min fatigue protocol, in which the bundles were stimulated with tetani of 1,2 s duration with pulses of 1 ms duration, 100 V and 15 Hz every 5 s. From the recordings of isometric single twitches peak force, the rise time (AZ) and the 50 % relaxation time (RZ) were calculated. From the recordings of tetani maximum force and the 50% RZ were estimated. In glucose-free Krebs-Henseleit solution the muscle fibre bundles of the CA III KO-muscles showed reduced peak force compared to the bundles of the wild-type muscles and both an accelerated AZ and 50% RZ. These effects occurred in the single twitches as well as in the tetani. During the fatigue tests, after 40 min the CA III KO muscle fibres showed a 20 % increase in fatigue compared to the WT fibres. All parameters of the CA III KO fibres were significantly different from those of the WT fibres. Simultaneous measurements of Fura-2 signals and single twitches, as well as of Fura-2 signals and Tetani showed that neither the decrease in force production was due to a reduced Ca2+ release from the sarcoplasmatic reticulum (SR), nor the accelerated AZ, was due to an accelerated Ca2+ release, nor the accelerated 50% RZ was accompanied by an accelerated Ca2+ uptake into the SR. There is only one exception: the accelerated 50% RZ of tetani was accompanied by an accelerated 50 % decay time of the Fura-2 ratio within the KO-fibres. Measurements with the pH indicator BCECF, AM showed that there are no differences between WT and CA III KO muscle fibres under resting conditions, i.e. without stimulation, concerning the intra cellular pH value (pHi). Thus, the changes in contraction parameters of single twitches and tetani between WT and KO fibres are not due to a different pHi. The BCECF measurements, which were conducted before and directly after the 40 min fatigue test, also showed that an intracellular acidosis neither developed in the WT muscle fibres nor in the CA III KO muscle bundles via the fatigue protocol. Therefore, the more distinct fatigue behaviour of the CA III KO bundles is not caused by a pH effect. In presence of 10 mM exogenous glucose compared to glucose-free solution the KO bundles showed an increase in force as well as in AZ and 50% RZ. On the other hand, the WT muscle fibres were not affected by glucose. In glucose-containing perfusion solution no differences between WT and KO muscles fibres could be observed concerning the contraction parameters. During the fatigue test the WT fibres were not affected by glucose, while the KO fibres developed a greater force. Therefore, WT and KO fibres showed a similar fatigue behaviour under glucose conditions. Series, starting with glucose-free solution for 2 h and then switching to glucose-containing solution for further 3 h, showed that changes in contraction parameters of single twitches in the KO fibres were irreversible by adding glucose. In an other series, starting with a glucose-containing solution, and then switching to glucose-free solution, the subtraction of glucose effects only a shortening of 50% RZ in KO muscle fibres. The expected decline in force and shortening in AZ failed to appear. In order to analyse the possible function of CA III as an anti-oxidant agent isometric contractions were performed using two different oxygen partial pressures (pO2). So far, the Krebs-Henseleit solution was equilibrated with 95% O2 and 5% CO2 in the above described studies. With this gassing, there was a pO2 of 513 ± 4 mmHg in the contraction chamber. In another series, the Krebs-Henseleit solution was equilibrated with 30% O2, 65% N2 and 5% CO2. Under this condition, the pO2 in the contraction chamber was 178 ± 1 mmHg. Under the lower pO2 KO muscle fibres still developed a reduced force of twitches compared to WT fibres, yet this difference was significantly smaller than under the higher pO2. Under the lower pO2 AZ and 50% RZ of single twitches from WT and KO fibres were similar. Similarly, there was no difference between WT and KO fibres concerning the decline of fractional tetanic forces during the fatigue period. These results are consistent with the assumption that CA III protects the muscle cells from oxidative damage. However, under low pO2 differences in tetani and in the courses of absolute tetanic forces between WT and KO fibres could still be observed. The reduced force development and the accelerated contraction kinetics of the CA III KO bundles in comparison to the WT fibre bundles, which has been observed in the absence of exogenous glucose, are neither caused by a modified Ca2+ transient nor by a modified pHi. Thus, it is assumed that changes of the myofilaments of the KO fibres are responsible for these observed effects. The findings, that WT and KO fibres show a similar contraction behaviour in presence of 10 mM exogenous glucose, show that the effects seen in the KO fibres are not caused by a modified myosin pattern. The findings, which were obtained under a lowered pO2 in the perfusion solution, lead to the assumption that CA III protects the oxidative glycolytic muscle fibres from damage by oxygen radicals. Oxygen radicals cause decline in the Ca2+ sensitivity of the myofilaments. It is proposed that the CA III KO muscle fibres are protected from oxidative damage to a lesser extend than WT fibres. Thus oxygen radicals could reduce the Ca2+ sensitivity under the application of 95% O2 in the CA III KO fibres. This again could cause the observed changes in the contraction and fatigue behaviour.

Die Carboanhydrase (CA) III ist ein zytosolisches Isoenzym, das in roten, oxidativen und langsam kontrahierenden Muskelfasern (Typ 1) sowie in Fett- und Leberzellen vorkommt. In dieser Arbeit sollte die mögliche Funktion der CA III in Typ 1-Muskelfasern untersucht werden. Dazu wurden isolierte, intakte Muskelfaserbündel vom M. soleus von CA III Knockout (KO)-Mäusen sowie von Wildtyp (WT)-Geschwistertieren verwendet. Diese Muskelbündel wurden mit Einzelreizen von 1 ms Dauer und supramaximaler Spannung direkt stimuliert und die isometrischen Einzelzuckungen registriert. Ein vollständiger Tetanus wurde durch eine Reizserie von 1 ms Reizen mit 100 V bei einer Frequenz von 50 Hz für eine Dauer von 1,5 s ausgelöst. Das Ermüdungsverhalten wurde durch ein 40 min Ermüdungsprotokoll untersucht, bei dem die Muskelfaserbündel mit Tetani von 1,2 s Dauer mit Reizen von 1 ms Reizbreite, 100 V Reizspannung und 15 Hz alle 5 s stimuliert wurden. Aus den Registrierungen der Einzelzuckungen wurden die isometrischen Kräfte, die Anstiegszeit (AZ) und die 50% Relaxationszeit (50% RZ) ausgewertet, aus den Registrierungen der Tetani die maximale Kraft und 50% RZ.   In glukosefreier Krebs-Henseleit-Lösung zeigten die Muskelbündel der CA III KO-Muskeln im Vergleich zu den Bündeln der WT-Muskeln eine geringe Kraftentwicklung und eine beschleunigte AZ sowie 50% RZ. Diese Effekte traten sowohl in den Einzelzuckungen als auch in den Tetani auf. Im Ermüdungsversuch zeigten die CA III KO-Muskelfasern nach 40 min eine ca. 20% stärkere Ermüdung als die WT-Fasern. Alle genannten Parameter der CA III KO-Fasern waren signifikant von denen der WT-Fasern verschieden. Gleichzeitige Messungen von Fura-2-Signalen und Einzelzuckungen bzw. von Fura-2-Signalen und Tetani ergaben, dass weder die verminderte Kraftentwicklung auf einer verminderten Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) beruht, noch die beschleunigte AZ bzw. 50% RZ auf einer beschleunigten Ca2+-Freisetzung bzw. einer beschleunigten Ca2+-Wiederaufnahme in das SR beruht. Diese Aussage gilt bis auf eine Ausnahme. Die beschleunigte 50% RZ der Tetani war in den KO-Fasern von einer beschleunigten 50% Abklingzeit der Fura-2 Ratio begleitet. Messungen mit dem pH-Indikator BCECF, AM ergaben, dass WT- und CA III KO-Muskelfasern unter Ruhebedingungen, d.h. ohne Stimulation, sich nicht im intrazellulären pH-Wert (pHi) unterscheiden. Die Veränderungen der Kontraktionsparameter in Einzelzuckung und Tetanus zwischen WT- und KO-Fasern beruhen folglich nicht auf einem unterschiedlichen pHi. Ferner zeigten die BCECF-Messungen, die vor und direkt nach dem 40 min Ermüdungsversuch durchgeführt werden, dass durch das Ermüdungsprotokoll weder in den WT-Muskelfasern noch in den CA III KO-Fasern eine intrazelluläre Acidose entsteht. Das stärker ausgeprägte Ermüdungsverhalten der CA III KO-Muskelbündel beruht also nicht auf einem pH-Effekt. In Anwesenheit von 10 mM exogener Glukose im Vergleich zu glukosefreier Lösung entwickelten die KO-Muskelfaserbündel mehr Kraft und die AZ sowie die 50% RZ verlängerten sich. Die WT-Muskelfasern dagegen blieben von Glukose unbeeinflusst. In glukosehaltiger Perfusionslösung bestehen zwischen WT- und KO-Fasern keine Unterschiede mehr im Kontraktionsverhalten. Auch während des Ermüdungsversuches blieben die WT-Fasern von Glukose unbeeinflusst, während die KO-Fasern mehr Kraft entwickelten und so unter Glukose WT- und KO-Fasern ein ähnliches Ermüdungsverhalten zeigten. Versuche, in denen mit glukosefreier Lösung begonnen wurde und nach 2 h auf glukosehaltige Lösung für weitere 3 h gewechselt wurde, zeigten, dass die Veränderungen in den Kontraktionsparametern der Einzelzuckung bei den KO-Muskelbündeln durch die Zugabe von Glukose nicht umkehrbar waren. In der Versuchsserie, in der mit glukosehaltiger Lösung begonnen wurde, kam es durch die Wegnahme der Glukose nur in der 50% RZ zu einer Verkürzung bei den KO-Muskelbündeln. Die erwartete Abnahme der Kraft und die Verkürzung der AZ blieben aus. Um die mögliche Funktion der CA III als Schutz vor Sauerstoffradikalen zu untersuchen, wurden die Kontraktionsversuche bei zwei verschiedenen Sauerstoffpartialdrücken (pO2) durchgeführt. In den bisher beschriebenen Versuchsserien war die Krebs-Henseleit-Lösung mit 95% O2/ 5% CO2äquilibriert worden. Bei dieser Begasung herrschte in der Messkammer ein pO2 von 513 ± 4 mmHg. In einer weiteren Serie wurde die Krebs-Henseleit-Lösung mit 30% O2/ 65% N2 / 5% CO2äquilibriert, unter diesen Bedingungen herrschte in der Messkammer ein pO2 von 178 ± 1 mmHg. Unter dem geringeren pO2 entwickelten die KO-Muskelfasern zwar immer noch eine geringere Kraft in der Einzelzuckung als die WT-Fasern. Dieser Unterschied war aber deutlich kleiner als unter höherem pO2. Unter geringerem pO2 waren AZ und 50% RZ der Einzelzuckungen von WT- und KO-Fasern gleich lang. Ebenso konnte unter niedrigerem pO2 kein Unterschied mehr im Abfall der fraktionellen tetanischen Kräfte während der Ermüdung zwischen WT- und KO-Fasern beobachtet werden. Diese Befunde stehen im Einklang zur Annahme, dass die CA III die Muskelzelle vor Sauerstoffradikalen schützt. Allerdings blieben auch unter niedrigerem pO2 die Unterschiede in den Tetani und im Verlauf der absoluten tetanischen Kräfte zwischen WT- und KO-Fasern bestehen. Die verminderte Kraftentwicklung und die beschleunigte Kontraktionskinetik der CA III KO-Muskelfaserbündel im Vergleich zu den WT-Muskelbündeln, die in Abwesenheit von exogener Glukose zu beobachten sind, beruhen weder auf einem veränderten Ca2+-Transienten noch auf einem verändertem pHi. Daraus kann man schließen, dass sehr wahrscheinlich Veränderungen an den Myofilamenten der KO-Fasern für diese Effekte verantwortlich sind. Durch den Befund, dass in Anwesenheit von 10 mM exogener Glukose KO- und WT-Muskelfasern dasselbe Kontraktionsverhalten zeigen, wird deutlich, dass die Kontraktionseffekte in den KO-Fasern nicht auf einem veränderten Myosin-Muster beruhen. Die Befunde, die unter einem erniedrigten pO2 in der Perfusionslösung erhoben wurden, legen die Annahme nahe, dass die CA III überwiegend oxidativ arbeitende Muskelfasern vor einer Schädigung durch Sauerstoffradikale schützt. Sauerstoffradikale bewirken an der Muskelzelle eine Abnahme der Ca2+-Sensitivität des myofibrillären Apparates. Es wird vermutet, dass die CA III KO-Muskelfasern weniger vor Sauerstoffradikalen geschützt sind als die WT-Fasern und dass deshalb unter Verwendung von 95% O2 in den CA III KO-Fasern Sauerstoffradikale zu einer Abnahme der Ca2+-Sensitivität geführt haben, die wiederum zu den Veränderungen im Kontraktions- und Ermüdungsverhalten geführt haben könnte.

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Reupke, Nils: Untersuchungen zur möglichen Funktion der zytosolischen Carboanhydrase III in oxidativen, langsam kontrahierenden Muskelfasern der Maus. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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