Untersuchungen zur möglichen Funktion der zytosolischen Carboanhydrase III in oxidativen, langsam kontrahierenden Muskelfasern der Maus

Die Carboanhydrase (CA) III ist ein zytosolisches Isoenzym, das in roten, oxidativen und langsam kontrahierenden Muskelfasern (Typ 1) sowie in Fett- und Leberzellen vorkommt. In dieser Arbeit sollte die mögliche Funktion der CA III in Typ 1-Muskelfasern untersucht werden. Dazu wurden isolierte, intakte Muskelfaserbündel vom M. soleus von CA III Knockout (KO)-Mäusen sowie von Wildtyp (WT)-Geschwistertieren verwendet. Diese Muskelbündel wurden mit Einzelreizen von 1 ms Dauer und supramaximaler Spannung direkt stimuliert und die isometrischen Einzelzuckungen registriert. Ein vollständiger Tetanus wurde durch eine Reizserie von 1 ms Reizen mit 100 V bei einer Frequenz von 50 Hz für eine Dauer von 1,5 s ausgelöst. Das Ermüdungsverhalten wurde durch ein 40 min Ermüdungsprotokoll untersucht, bei dem die Muskelfaserbündel mit Tetani von 1,2 s Dauer mit Reizen von 1 ms Reizbreite, 100 V Reizspannung und 15 Hz alle 5 s stimuliert wurden. Aus den Registrierungen der Einzelzuckungen wurden die isometrischen Kräfte, die Anstiegszeit (AZ) und die 50% Relaxationszeit (50% RZ) ausgewertet, aus den Registrierungen der Tetani die maximale Kraft und 50% RZ.   In glukosefreier Krebs-Henseleit-Lösung zeigten die Muskelbündel der CA III KO-Muskeln im Vergleich zu den Bündeln der WT-Muskeln eine geringe Kraftentwicklung und eine beschleunigte AZ sowie 50% RZ. Diese Effekte traten sowohl in den Einzelzuckungen als auch in den Tetani auf. Im Ermüdungsversuch zeigten die CA III KO-Muskelfasern nach 40 min eine ca. 20% stärkere Ermüdung als die WT-Fasern. Alle genannten Parameter der CA III KO-Fasern waren signifikant von denen der WT-Fasern verschieden. Gleichzeitige Messungen von Fura-2-Signalen und Einzelzuckungen bzw. von Fura-2-Signalen und Tetani ergaben, dass weder die verminderte Kraftentwicklung auf einer verminderten Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) beruht, noch die beschleunigte AZ bzw. 50% RZ auf einer beschleunigten Ca2+-Freisetzung bzw. einer beschleunigten Ca2+-Wiederaufnahme in das SR beruht. Diese Aussage gilt bis auf eine Ausnahme. Die beschleunigte 50% RZ der Tetani war in den KO-Fasern von einer beschleunigten 50% Abklingzeit der Fura-2 Ratio begleitet. Messungen mit dem pH-Indikator BCECF, AM ergaben, dass WT- und CA III KO-Muskelfasern unter Ruhebedingungen, d.h. ohne Stimulation, sich nicht im intrazellulären pH-Wert (pHi) unterscheiden. Die Veränderungen der Kontraktionsparameter in Einzelzuckung und Tetanus zwischen WT- und KO-Fasern beruhen folglich nicht auf einem unterschiedlichen pHi. Ferner zeigten die BCECF-Messungen, die vor und direkt nach dem 40 min Ermüdungsversuch durchgeführt werden, dass durch das Ermüdungsprotokoll weder in den WT-Muskelfasern noch in den CA III KO-Fasern eine intrazelluläre Acidose entsteht. Das stärker ausgeprägte Ermüdungsverhalten der CA III KO-Muskelbündel beruht also nicht auf einem pH-Effekt. In Anwesenheit von 10 mM exogener Glukose im Vergleich zu glukosefreier Lösung entwickelten die KO-Muskelfaserbündel mehr Kraft und die AZ sowie die 50% RZ verlängerten sich. Die WT-Muskelfasern dagegen blieben von Glukose unbeeinflusst. In glukosehaltiger Perfusionslösung bestehen zwischen WT- und KO-Fasern keine Unterschiede mehr im Kontraktionsverhalten. Auch während des Ermüdungsversuches blieben die WT-Fasern von Glukose unbeeinflusst, während die KO-Fasern mehr Kraft entwickelten und so unter Glukose WT- und KO-Fasern ein ähnliches Ermüdungsverhalten zeigten. Versuche, in denen mit glukosefreier Lösung begonnen wurde und nach 2 h auf glukosehaltige Lösung für weitere 3 h gewechselt wurde, zeigten, dass die Veränderungen in den Kontraktionsparametern der Einzelzuckung bei den KO-Muskelbündeln durch die Zugabe von Glukose nicht umkehrbar waren. In der Versuchsserie, in der mit glukosehaltiger Lösung begonnen wurde, kam es durch die Wegnahme der Glukose nur in der 50% RZ zu einer Verkürzung bei den KO-Muskelbündeln. Die erwartete Abnahme der Kraft und die Verkürzung der AZ blieben aus. Um die mögliche Funktion der CA III als Schutz vor Sauerstoffradikalen zu untersuchen, wurden die Kontraktionsversuche bei zwei verschiedenen Sauerstoffpartialdrücken (pO2) durchgeführt. In den bisher beschriebenen Versuchsserien war die Krebs-Henseleit-Lösung mit 95% O2/ 5% CO2äquilibriert worden. Bei dieser Begasung herrschte in der Messkammer ein pO2 von 513 ± 4 mmHg. In einer weiteren Serie wurde die Krebs-Henseleit-Lösung mit 30% O2/ 65% N2 / 5% CO2äquilibriert, unter diesen Bedingungen herrschte in der Messkammer ein pO2 von 178 ± 1 mmHg. Unter dem geringeren pO2 entwickelten die KO-Muskelfasern zwar immer noch eine geringere Kraft in der Einzelzuckung als die WT-Fasern. Dieser Unterschied war aber deutlich kleiner als unter höherem pO2. Unter geringerem pO2 waren AZ und 50% RZ der Einzelzuckungen von WT- und KO-Fasern gleich lang. Ebenso konnte unter niedrigerem pO2 kein Unterschied mehr im Abfall der fraktionellen tetanischen Kräfte während der Ermüdung zwischen WT- und KO-Fasern beobachtet werden. Diese Befunde stehen im Einklang zur Annahme, dass die CA III die Muskelzelle vor Sauerstoffradikalen schützt. Allerdings blieben auch unter niedrigerem pO2 die Unterschiede in den Tetani und im Verlauf der absoluten tetanischen Kräfte zwischen WT- und KO-Fasern bestehen. Die verminderte Kraftentwicklung und die beschleunigte Kontraktionskinetik der CA III KO-Muskelfaserbündel im Vergleich zu den WT-Muskelbündeln, die in Abwesenheit von exogener Glukose zu beobachten sind, beruhen weder auf einem veränderten Ca2+-Transienten noch auf einem verändertem pHi. Daraus kann man schließen, dass sehr wahrscheinlich Veränderungen an den Myofilamenten der KO-Fasern für diese Effekte verantwortlich sind. Durch den Befund, dass in Anwesenheit von 10 mM exogener Glukose KO- und WT-Muskelfasern dasselbe Kontraktionsverhalten zeigen, wird deutlich, dass die Kontraktionseffekte in den KO-Fasern nicht auf einem veränderten Myosin-Muster beruhen. Die Befunde, die unter einem erniedrigten pO2 in der Perfusionslösung erhoben wurden, legen die Annahme nahe, dass die CA III überwiegend oxidativ arbeitende Muskelfasern vor einer Schädigung durch Sauerstoffradikale schützt. Sauerstoffradikale bewirken an der Muskelzelle eine Abnahme der Ca2+-Sensitivität des myofibrillären Apparates. Es wird vermutet, dass die CA III KO-Muskelfasern weniger vor Sauerstoffradikalen geschützt sind als die WT-Fasern und dass deshalb unter Verwendung von 95% O2 in den CA III KO-Fasern Sauerstoffradikale zu einer Abnahme der Ca2+-Sensitivität geführt haben, die wiederum zu den Veränderungen im Kontraktions- und Ermüdungsverhalten geführt haben könnte.