Untersuchung der Leukotrienwirkung am Pferdebronchus mittels "precision-cut lung slices" (PCLS)

Schwalfenberg, Barbara

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Untersuchung der Leukotrienwirkung am Pferdebronchus mittels "precision-cut lung slices" (PCLS)

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Ziel der vorliegenden Studie war es, die von VIETMEIER (2004) für die equine Lunge etablierte Technik der Herstellung von PCLS weiterzuentwickeln, und die Leukotrien C4-Wirkung am Pferdebronchus sowie ihre Beeinflussbarkeit durch den spezifischen Leukotrienrezeptorantagonisten MK-571 zu untersuchten. Dabei war von besonderem Interesse, ob zwischen dem klinischen COB-Erkrankungsgrad und der Reagibilität der Bronchien ex-vivo ein Zusammenhang hinsichtlich der bronchokonstriktorischen Leukotrien C4-Wirkung und Hemmbarkeit derselben durch den Rezeptorantagonisten MK-571 besteht. Für die Studie standen insgesamt 16 Probanden zur Verfügung. Die Entnahme, Aufbereitung und Mikroskopie wurde zuvor an sieben krankheitsbedingt euthanasierten Pferden erprobt. Vor Beginn der Versuche wurde die Lungengesundheit der Pferde nach dem Score-System nach OHNESORGE et al. (1998) beurteilt. Dazu wurden die Ergebnisse einer klinischen Allgemeinuntersuchung und einer speziellen klinischen Untersuchung (einschließlich Bronchoskopie, TBS- und Blutgasanalyse) einen Tag vor der Euthanasie herangezogen. Die einzelnen Parameter wurden abhängig von ihrer Schwere nach dem Score-System beurteilt. Direkt post mortem wurde der Lobus accessorius über einen Interkostalschnitt entnommen und in sterile Kochsalzlösung auf Eis zum Transport verbracht. Im direkten Anschluss erfolgten die Herstellung der PCLS und ihre Inkubation unter Zellkulturbedingungen. Die Agarose wurde durch mehrfachen Wechsel des Medium ausgewaschen, und die Vitalität anhand des Zilienschlages des Atemwegsepithels sowie einer Bronchokonstriktion mittels Methacholin (10-3 mol/l) überprüft. Nach Abschluss der Vitalitätsprüfung fand eine zufällige Aufteilung der Schnitte auf zwei Serien (Serie A und Serie B) statt. Insgesamt wurden beide Serien drei Kontraktionsreihen unterzogen, in denen die Leukotriene in aufsteigenden Konzentrationen (10-12 bis 10-4 mol/l)appliziert wurden. Vor der zweiten Kontraktionsreihe wurden die Lungenschnitte der Serie B für 30 Minuten mit dem Rezeptorantagonisten MK-571 (10-9 mol/l) inkubiert. Im Anschluss an jede Kontraktionsreihe wurde durch mehrfachen Mediumwechsel eine Dilatation der Bronchien ermöglicht. Der Kontraktionszustand der Atemwege wurde in definierten Zeitabständen photographisch festgehalten, und mit Hilfe zweier Bildbearbeitungsprogramme digital ausgewertet. Dazu wurde die Bronchusfläche über die Markierung der luminalen Epithelgrenze bestimmt und prozentual zum Ausgangslumen berechnet. Anhand der ersten Kontraktionsreihe wurde die Konzentrations-Wirkungsbeziehung für Leukotrien C4 entwickelt. Leukotrien C4 verursacht in allen vitalen PCLS eine konzentrationsabhängige Bronchokonstriktion, die sich im Vergleich zum Ausgangslumen, ab der Konzentration von 10-8 mol/l signifikant darstellt. Im Vergleich der Serie A und Serie B in der zweiten Kontraktionsreihe konnte die signifikante Hemmung der leukotrieninduzierten Bronchokonstriktion durch den Rezeptorantagonisten MK-571 beobachtet werden. Die dritte Kontraktionsreihe diente zur Überprüfung der Reversibilität der MK-571-Wirkung und dem Erhalt der Vitalität. Es konnte weder eine Restwirkung der MK-571-Wirkung, noch ein Verlust der Vitalität festgestellt werden. In den Untersuchungen wurde deutlich, dass die Bronchien COB-erkrankter Pferde signifikant stärker auf Leukotrien C4 reagieren als die gesunder Probanden. Die Reaktion der Atemwege nach Hemmung der Bronchokonstriktion durch den Rezeptorantagonisten MK-571 unterschied sich zwischen den beiden Gruppen, eventuell auch durch allgemein stark gehemmte Reaktion, nicht. In der vorliegenden Studie konnte die Eignung des ex-vivo Modells der PCLS als Screening-Modell für Bronchokonstriktoren und ihre Hemmer an der equinen Lunge bestätigt werden. Durch die Vielzahl der PCLS, die pro Pferd gewonnen werden können, verringert sich die Anzahl der benötigten Probanden. Es wurden grundlegende Erkenntnisse zur Leukotrienwirkung am Pferdebronchus, sowie ihrer Antagonisierbarkeit durch den Leukotrienrezeptorantagonisten MK-571 gewonnen. Eine Hyperreagibilität der Bronchien COB-erkankter Tiere auf Leukotrien C4, konnte im Vergleich zu gesunden Probanden nachgewiesen werden. Abschließend kann festgestellt werden, dass die Leukotriene im Rahmen der equinen COB durchaus eine Rolle spielen und als Angriffspunkt für die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten betrachtet werden können.

This study set out to advance the technique of precision-cut lung slices established by VIETMEIER (2004) for equine lungs, as well as to investigate the leukotriene C4 effects on the equine bronchus and the interference of the specific leukotriene receptor antagonist MK-571. More specifically, the question of whether there is coherence between severity of horses COB-affection and reactivity of the bronchi ex vivo regarding the bronchoconstrictive leukotriene C4 effect and its inhibition by the receptor antagonist MK-571 was addressed. 16 horses were available for the study. The extraction, preparation and microscopy were tested at seven horses, which were euthanized due to other diseases before. Prior to the experiments the condition of the horses’ lungs was evaluated using the Score-System according to OHNESORGE et al. (1998). The results of a clinical examination and an examination of the respiratory tract (including a bronchoscopy, analysis of aspirated tracheobronchial secret and arterial blood gas analysis) obtained one day before euthanasia were used. Parameters were rated by the score-system depending on their severity. Immediately post mortem the Lobus accessories was extracted through an intercostal incision and was deposited in sterile saline (0, 9%) and on ice for transport. Subsequently, the production of PCLS was carried out and the PCLS were incubated under cell culture conditions. The agarose was washed out by several exchange of medium, and vitality was inspected by beating of the airway cilia and by bronchoconstriction after applying methacholine (10-3 mol/l). After testing the vitality, the slices were randomly divided into two series (A and B). Both series were subjected to increasing concentrations (10-12 to 10-4 mol/l) of leukotriene C4 three times. Prior to the second increase of contraction, one series (B) was incubated with the receptor antagonist MK-571 for 30 minutes. The reopening of the bronchi was made possible by repeated exchange of medium after every run of contraction. The status of contraction of the bronchi was photographed in defined intervals, and digitally evaluated, using two picture editing programs. As a result, it was possible to evaluate the area of bronchial lumen and percentile calculations in relation to the initial lumen were conducted. Using the first increase of leukotriene C4 concentration, the concentration-response curve was developed. In any vital PCLS leukotriene C4 causes a concentration depending bronchoconstriction, which is significantly different (in relation to initial lumen) at 10-8 mol/l leukotriene. After the second increase, a significant inhibition of the leukotriene-induced bronchoconstriction in comparison of series A and series B was detected. The last run of leukotriene application was used to proove the reversibility of the MK-571 effect and the preservation of vitality. However, neither a residual effect of the MK-571- effect nor a loss of vitality was detected. Throughout the study it became apparent, that airways of COB-affected horses react significantly stronger to leukotriene C4 than those of healthy horses. Reaction of airways after inhibition of bronchoconstriction by the receptor antagonist MK-571 was not different between the two groups, possibly because of the generally inhibited reaction. In the present study we confirmed the usefulness of the ex-vivo-model PCLS as a screening-model for bronchoconstrictors and their inhibitors at the equine lung. By the multitude of slices obtained from one horse, the number of subjects needed is reduced. We were able to gain basic principles of the leukotriene effect on horses’ bronchi and its compensability by the leukotriene receptor antagonist MK-571. A hyperreagibility of the bronchi of COB-affected horses in comparison to healthy horses could be demonstrated. We conclude, that leukotrienes may play an important role in context with COB, and that they may be considered as a new therapeutical target.