Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunologische Untersuchungen zur Gewinnung und Charakterisierung dendritischer Zellen (DC) vom Pferd im Hinblick auf eine DC-Therapie des equinen Sarkoids

Siffrin, Eva

Dendritic cells of the horse are key initiators of a wide range of immune reactions against equine sarcoids. Peripheral blood monocytes are a suitable source to generate dendritic cells (DC) in vitro under appropiate conditions. Thus, aiming for a high yield of peripheral blood monocytes which have neither been preselected nor preactivated by the harvesting procedure we scrutinized different published methods. Monocyte derived DC were characterised phenotypically by means of their expression of CD83 and CD 86 and functionally in respect to their antigen presenting capacity. The following results were achieved: 1. Separation of equine monocytes from whole blood An enrichment of equine monocytes due to their adherence on plastic surfaces turned out to be ineffective, because it comprised a considerable loss of monocytes and an insufficient purity of maximally 30% of the mononuclear cell (MNC) fraction. Depleting MNC from CD4 and CD8 positive cells by magnetic cell sorting (MACS) resulted in a higher purity of monocytes (up to 40% of MNC) but with an unacceptable low gain of only 6.4% of the MNC to start with plus a selective loss of CD4 and CD8 positive monocytes. Enrichment of IgE positive monocytes via MACS separation resulted in an impressive purity of monocytes (up to 70% of MNC). Disadvantages of that method were, however, a selection of a monocyte subset (IgE positive monocytes only were retrieved) and a very low yield of monocytes (only 1.6% of the monocytes available). The best method to enrich for equine monocytes proved to be an overlay of leukocyte-rich-plasma on a slightly hyperosmotic (340 ± 10 mOsm/kg) gradient of 50% percoll followed by density centrifugation, resulting in a purity of 50% to 90% monocytes and yield of 70% of the monocytes available. Highly influencial on the outcome of the latter procedure, however, is the anticoagulant used and the time between harvest and processing of the blood. 2. Generation of dendritic cells and phenotypical characterisation of the DCs For phenotypical characterisation of the generated dendritic cells, monoclonal antibodies (mAb) against human CD83 and human CD86 were used. They labelled exclusively cells, residing in the morphological region of DCs in flowcytometric analyses. Lymphocytes or freshly isolated monocytes were negative for both mAbs. When IgE positive cells were enriched and cultured with huGM-CSF and req. IL4, a clear expression of the surface molecules CD83 and CD86 already appeared after 3 days in cell culture. Monocytes enriched by hyperosmotic density gradient centrifugation required 7 days in cell culture with huGM-CSF and req. IL4 to reach a comparable expression level of these surface markers. In man and mouse CD83 expression indicates the differentiation to mature DC (mDC), it remains unclear whether CD83 is expressed on immature DC (iDC) in horse as well. A final stimulation of differentiating equine DCs with LPS did not lead to an increased expression of CD83. 3. Antigen presenting functionality of in vitro generated DC The antigen presenting capacity of the DCs were tested in allogeneic and autologous mixed leucocyte reactions (MLR). Initially unpulsed (without exogenous antigen loaded) DC were examined. In comparison to the medium control T-cell proliferation increased significantly in the presence of allogeneic DCs. However, this stimulation did not differ significantly from that induced by allogeneic freshly isolated monocytes. Unpulsed DCs did not stimulate autologous T-cells to a significant proliferation but rather inhibited their proliferation in single animals. Likewise T-cell proliferation was also inhibited by freshly isolated, autologous monocytes. Exogenous loading of DC with antigen (antigen pulse) 24h before application of the DC as stimulator cells in MLR, caused a clear stimulations of allogeneic as well as autologous T-cells. However, it was decisive which antigens were presented by the DC: Autologous DC pulsed with allogeneic tumour material or BSA (bovine serum albumin) as antigen source initiated a clear stimulation of T-cells, while DCs pulsed with autologous tumourcell lysat turned out to be less effective in inducing autologous T-cell proliferation. Based on these results it is now possible to generate sufficient amounts of equine dendritic cells from highly enriched peripheral blood monocytes which are neither preactivated nor preselected. The in vitro generated DC are capable of taking up antigens and presenting them efficiently to T-cells. This permits their therapeutic application in the treatment of equine sarcoids. The intratumorale application of autologous, unpulsed DC is recommended.

Dendritische Zellen des Pferdes sind zentrale Initiatoren einer breiten Immunantwort gegen equine Sarkoide. Zur Herstellung dendritischer Zellen (DC) können Monozyten des peripheren Blutes als Ausgangspopulation verwendet werden, die unter geeigneten Kulturbedingungen in vitro zu DCs differenzieren. Da für die Separation equiner Monozyten noch keine ausreichend effektiven Methoden beschrieben sind, wurden verschiedene Verfahren der Aufreinigung untersucht und miteinander verglichen. Des Weiteren galt es, die in vitro generierten DCs phänotypisch und funktionell zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Separation equiner Monozyten aus Vollblut Eine Anreicherung equiner Monozyten über ihr Adhärenzverhalten an Plastikoberflächen erwies sich als uneffektiv, da sie mit erheblichen Monozytenverlusten einherging und keine ausreichende Reinheit der Population erbrachte. Die beste Reinheit an Monozyten, die in dieser Arbeit erzielt werden konnte lag bei 30% aller MNC. Durch die Depletion equiner mononukleärer Zellen (MNC) von CD4 und CD8 positiven Zellen mittels magnetischer Zellsortierung (MACS) konnte zwar eine deutliche relative Anreicherung von Monoyzten (fast 40% aller MNC) erreicht werden, jedoch lag die Ausbeute der an Monozyten angereicherten MNC bei geringen 6,4% der eingesetzten MNC. Zudem fand eine Selektion bestimmter Monozytensubtypen statt, da CD4 und CD8 positive monozytoide Zellen bei diesem Verfahren ebenfalls entfernt wurden. Eine Anreicherung von Monzyten über ihr membrangebundenes IgE im MACS führte zwar zu einer Monozytenreinheite von bis zu 70% der MNC. Nachteil war allerdings, dass auch hier eine Selektion bestimmter Subtypen (IgE positiver Monozyten) stattfand. Des Weiteren wurden von den vorhandenen Monozyten mit diesem Verfahren nur sehr wenige gewonnen: 1,6% der Ausgangspopulation an Monozyten. Als beste Methode, equine Monozyten zu separieren erwies sich eine Dichtegradientenzentrifugation, bei der leukozytenreiches Plasma über einen 50%igen, leicht hypertonen (340 ± 10 mOsm/kg) Percollgradienten® geschichtet wurde. Der erzielte relative Monozytenanteil an den MNC lag zwischen 50 und 90% mit einer Ausbeute an Monozyten von 70%. Als entscheidende Einflussfaktoren stellten sich bei dieser Methode das verwendete Antikoagulanz und der Zeitraum zwischen Entnahme und Verarbeitung des Blutes. 2. Generierung dendritischer Zellen und ihre phänotypische Charakterisierung Zur phänotypischen Charakterisierung equiner dendritischer Zellen wurden monoklonale Antikörper (mAK) gegen humanes CD83 und humanes CD86 verwendet. Diese mAK banden nur an Zellen, die in durchflusszytometrischen Analysen im Bereich der DC lagen. Lymphozyten oder frisch isolierte Monozyten waren für beide AK in der Membranimmunfluoreszenz negativ. Wurden über IgE angereicherte Zellen mit huGM-CSF und req.IL4 kultiviert, zeigte sich bereits nach 3 Tagen Kultur eine deutliche Expression der Oberflächenmoleküle CD83 und CD86. Monozyten, die über hypertone Dichtegradientenzentrifugation gewonnen wurden, benötigten dafür 7 Tage Differenzierungszeit, um ein vergleichbares Expressionsniveau dieser Oberflächenmarker zu erreichen. Obwohl CD83 bei Mensch und Maus einen Reifungsmarker darstellt, der nur auf maturen DC (mDC) zu finden ist, bleibt es offen, ob CD83 beim Pferd evtl. schon auf immaturen DC (iDC) expremiert wird. Eine finale Stimulation mit LPS führte zu keiner Expressionssteigerung von CD83 auf equinen DC.   3. Antigen präsentierende Funktion der in vitro generierten DC  In gemischten Leukozytenreaktionen (MLR) wurde die antigenpräsentierende Funktion der DCs in allogenen und autologen Ansätzen überprüft. Zunächst wurden die Zellen ungepulst, d.h. ohne exogene Beladung mit Antigen untersucht. Im Vergleich zur Mediumkontrolle zeigte sich nur bei allogenen T-Zellen eine signifikante Proliferationssteigerung durch DCs, die sich jedoch von der Stimulation durch allogene, frisch isolierte Monozyten nicht signifikant unterschied. Autologe DC führten zu keiner signifikanten Steigerung des Stimulationsindex, erwiesen sich bei einzelnen Tieren sogar als proliferationsinhibierend. Eine Hemmung der Proliferation wurde ebenfalls beobachtet, wenn frisch isolierte, autologe Monozyten als Stimulatorzellpopulation fungierten. Eine Antigenpulsung (exogene Beladung mit Antigen) 24h vor Einsatz der DC in der MLR führte zu deutlichen Stimulationen allogener als auch autologer T-Zellen. Entscheidend war jedoch, welche Antigene durch die DC präsentiert wurden. So führten autologe DC zu einer deutlichen Stimulation wenn sie als Antigenquelle allogenes Tumormaterial oder BSA (bovines Serum-Albumin) erhielten. Mit autologem Tumorzelllysat gepulste, autologe DCs konnten nur eine geringe Proliferation der T-Zellen induzieren. Auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit ist es nun möglich, equine dendritische Zellen in größerer Menge aus hoch angereicherten und weder voraktivierten noch vorselektierten Monozyten zu generieren. Die in vitro generierten Zellen sind in der Lage, effektiv Antigene aufzunehmen und zu präsentieren, was ihren therapeutischen Einsatz zur Behandlung des equinen Sarkoids erlaubt. Empfohlen wird die intratumorale Applikation autologer, in vitro nicht-gepulster DC.

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Siffrin, Eva: Immunologische Untersuchungen zur Gewinnung und Charakterisierung dendritischer Zellen (DC) vom Pferd im Hinblick auf eine DC-Therapie des equinen Sarkoids. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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