Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunhistochemische Untersuchungen zur Proliferation und Apoptose im fetalen ovinen Gehirn nach experimenteller intrauteriner Infektion mit dem Virus der Bovinen Virusdiarrhoe

Szentiks, Claudia Anita

The aim of the study was to characterise proliferation and apoptosis in telencephalon and cerebellum of sheep foetuses which had been experimentally transplacentally infected between day 63 and 68 of gestation with ncp (10 foetuses) or cp BVDV (42 foetuses, 1 lamb). Foetuses infected with ncp BVDV were studied between day 10 and 47 post infection (p.i.) and foetuses infected with cp BVDV between day 10 and 81 p.i. For comparison, brains from 15 non infected sheep foetuses (age: 63 to 140 days) and from 1 lamb were used. The material comprised paraffin-embedded brains fixed in formalin, Bouin’s or Schmechel’s fluid. Immunohistochemical examinations (ABC-method) were carried out by using antibodies to activated Caspase 3 for detection of apoptosis and by using antibodies to proliferation associated antigen Ki-67. Immunohistochemical detection of BVDV antigen was performed by using a monoclonal antibody (15C5). Morphometrical evaluation of immunohistochemically detected apoptotic cells was performed by using a semiautomatic system and determination of apoptotic index (AI) and also the numbers of apoptotic nuclei per area (AN/A). Proliferation of cells was evaluated semiquantitatively by counting Ki-67 positive cells. Taking into account histopathological brain lesions the presence of apoptosis and Ki-67 positive cells and presence of BVDV antigen were correlated. Numbers and location of apoptotic nuclei in telencephalon and cerebellum of control foetuses resembled findings in foetal brains of man and rodents. In the telencephalon, apoptosis was mainly found in proliferatively active zones [ventricular zone (VZ), subventricular zone (SVZ)]. In the cerebellum, however, more apoptosis was present in the white matter and/or internal granular layer than in the external granular layer (EGL). In foetuses infected with ncp BVDV up to the age of 105 days significantly higher numbers of AN/A were found in the cortical plate (CP), VZ and SVZ of the telencephalon. In the cerebellum, a significantly higher number of AN/A were seen. In all foetuses (AN/A) or in 70% of foetuses (AI) more apoptosis was present in the VZ and SVZ than in the remaining zones of the telencephalon. In comparison to control foetuses and those infected with ncp BVDV the foetuses infected with cp BVDV had considerably more apoptosis in the CP than in the SVZ and VZ. In formalin-fixed brains of foetuses infected with cp BVDV up to the age of 105 days a significantly increased AI was found in the CP and intermediate zone of the telencephalon. Furthermore, significantly more AN/A were seen in the CP, VZ and SVZ of telencephalon and in the cerebellum in comparison to the control group. Concerning the topography of apoptosis in the cerebellum, only 2 of 42 (4.8%) of cp BVDV infected foetuses showed a difference in comparison to control foetuses and foetuses infected with ncp BVDV. In these 2 foetuses, increased apoptosis was located in the proliferatively active EGL. In summary, the results of this study suggest that infection with cp BVDV is responsible for increase of apoptosis in these foetuses. A convincing explanation for the finding of significantly increased apoptosis in the foetuses infected with ncp BVDV in comparison to control foetuses is missing. Whilst between foetuses infected with ncp BVDV and control foetuses no differences concerning the numbers of Ki-67 positive proliferating cells were present, significantly reduced proliferation was seen in the SVZ and VZ of the telencephalon of foetuses infected with cp BVDV. A possible explanation for this finding could be induction of apoptosis following early infection of progenitor cells. In 20% of foetuses infected with ncp BVDV and in 19% of foetuses infected with cp BVDV a positive topographic correlation between the presence of BVBV antigen and apoptosis was found. In the telencephalon of 9.5% of the latter foetuses, such a correlation was also found in the cerebellum. A possible explanation for the finding that only in some of the foetuses infected with cp BVDV such a positive correlation was present could be that the viral antigen had already been eliminated by infiltrating macrophages. In ncp foetuses, macrophages were only present in single cases within the telencephalon. In foetuses infected with cp BVDV up to the age of 105 days, however, in 30.8% of cases foci with macrophages were present in the telencephalon. In 7.6% of these foetuses, foci of macrophages were accompanied by the presence of BVDV antigen and apoptosis being located at the borders of these foci. In conclusion, these investigations did not reveal whether the cytopathic effect of the BVDV or whether macrophages infiltrating the brain tissue, possibly in combination with the cp virus, are responsible for the significantly increased apoptosis in foetuses infected with cp BVDV.

Ziel der Arbeit war es, die Proliferationsaktivität und das Auftreten von Apoptose im Telenzephalon und Kleinhirn von Schaffeten, welche experimentell, transplazentar zwischen Tag 63 und 68 der Trächtigkeit mit nzp (10 Feten) bzw. zp BVDV (42 Feten, 1 Lamm) infiziert worden waren, zu charakterisieren. Die nzp Feten wurden zwischen Tag 10 und 47 post infectionem (p.i.) und die zp Feten zwischen Tag 10 und 81 p.i. untersucht. Zum Vergleich dienten Gehirne von 15 nicht infizierten Schaffeten (Alter: 63 bis 140 Tage) sowie von 1 Lamm. Das Untersuchungsmaterial bestand aus Paraffinblöcken von in Formalin, Bouin´scher oder Schmechel´scher Lösung fixierten Gehirnproben. Es wurden immunhistochemische Untersuchungen (ABC Methode) unter Verwendung von Antikörpern gegen aktivierte Caspase 3 zur Darstellung von Apoptose und Antikörpern gegen das proliferationsassoziierte Antigen Ki-67 durchgeführt. Der immunhistochemische Nachweis von BVDV Antigen wurde mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers (15C5) vorgenommen. Die morphometrische Auswertung der immunhistochemisch dargestellten apoptotischen Zellen erfolgte mit Hilfe eines semiautomatischen Systems, wobei sowohl der apoptotische Index (AI) als auch die Zahl der apoptotischen Kerne pro Fläche (AK/F) ermittelt wurden. Die anhand der Ki-67 positiven Zellen ermittelte Zellproliferation wurde semiquantitativ ausgewertet. Unter Berücksichtigung der histopathologischen Gehirnveränderungen erfolgte eine Korrelation zwischen dem Auftreten von Apoptose bzw. Ki-67 positiver Zellen und dem Vorkommen von BVDV Antigen. Die im Telenzephalon und Kleinhirn der Kontrollfeten festgestellte Anzahl und Lokalisation apoptotischer Kerne entsprach Befunden, wie sie für fetale Gehirne von Mensch und Nagetieren beschrieben wurden. Im Telenzephalon war Apoptose mehrheitlich in den proliferativ aktiven Schichten [Ventrikular- (VZ) und Subventrikularzone (SVZ)] zu finden, während im Kleinhirn mehr Apoptose in der weißen Substanz und/oder der inneren Körnerschicht als in der äußeren Körnerschicht (ÄKS) vorkam. Bei mit nzp BVDV infizierten, bis 105 Tage alten Feten wurde in der Kortikalplatte (KP), VZ und SVZ des Telenzephalons und im Kleinhirn eine signifikant höhere Anzahl an AK/F ermittelt als bei den Kontrollfeten. Dabei war bei allen Feten (AK/F) bzw. bei 70% der Feten (AI) mehr Apoptose in der VZ und SVZ als in den übrigen Zonen des Telenzephalons vorhanden. Im Vergleich zu den Kontrolltieren und den nzp Feten war bei den mit zp BVDV infizierten Feten deutlich mehr Apoptose in der KP als in der SVZ und VZ festzustellen. Bei in Formalin fixierten Gehirnen der mit zp BVDV infizierten, bis 105 Tage alten Feten wurde ein signifikant erhöhter AI in der KP und Intermediärzone des Telenzephalons und signifikant mehr AK/F in der KP, VZ und SVZ des Telenzephalons und im Kleinhirn im Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt. Bezüglich der Topografie von Apoptose im Kleinhirn war lediglich bei 2 von 42 (4,8%) mit zp BVDV infizierten Feten ein Unterschied zu Kontrollfeten und mit nzp infizierten Feten festzustellen. Bei diesen beiden Feten war vermehrt Apoptose in der proliferativ aktiven ÄKS lokalisiert. Zusammenfassend ist aufgrund der Untersuchungsergebnisse zu vermuten, dass die Infektion mit zp BVDV für die vermehrt vorkommende Apoptose bei diesen Feten verantwortlich ist. Eine schlüssige Erklärung dafür, warum bei den mit nzp BVDV infizierten Feten signifikant vermehrt Apoptose als bei den Kontrollfeten vorkam, konnte nicht gefunden werden. Während zwischen den mit nzp BVDV infizierten Feten und den Kontrollfeten keine Unterschiede bezüglich der Zahl der Ki-67 positiven, proliferierenden Zellen vorlagen, war bei den mit zp BVDV infizierten Feten eine signifikant verminderte Proliferation in der SVZ und VZ des Telenzephalons zu beobachten. Dies lässt sich möglicherweise durch eine frühzeitige Infektion der Vorläuferzellen und hierdurch induzierte Apoptose erklären. Eine positive topografische Korrelation zwischen dem Vorkommen von BVDV Antigen und Apoptose im Telenzephalon wurde bei 20% der mit nzp BVDV infizierten Feten und bei 19% der mit zp BVDV infizierten Feten festgestellt. Bei letzteren fand sich ebenfalls eine derartige Korrelation im Kleinhirn bei 9,5% der Feten. Eine mögliche Erklärung dafür, dass nur bei einem Teil der Feten eine derartige positive Korrelation vorlag, könnte eine bereits erfolgte Elimination des Virusantigens durch einwandernde Makrophagen sein. Makrophagen waren bei den nzp Feten nur in Einzelfällen im Telenzephalon vorhanden. Bei den bis 105 Tage alten mit zp BVDV infizierten Feten waren hingegen in 30,8% der Fälle Herde mit Makrophagen im Telenzephalon vorhanden, wobei das gleichzeitige Auftreten von BVDV Antigen und Apoptose am Rand der Herde bei 7,6% der Feten zu beobachten war. Abschließend ist festzuhalten, dass in diesen Untersuchungen nicht geklärt werden konnte, ob nur der zytopathogene Effekt des BVDV für die signifikant verstärkte Apoptose bei den mit zp BVDV infizierten Feten verantwortlich war oder ob die das Gehirngewebe infiltrierenden Makrophagen, möglicherweise im Zusammenspiel mit dem zp Virus, für die signifikant verstärkte Apoptose bei den transplazentar mit zp BVDV infizierten Feten verantwortlich war.

Zitieren

Zitierform:

Szentiks, Claudia Anita: Immunhistochemische Untersuchungen zur Proliferation und Apoptose im fetalen ovinen Gehirn nach experimenteller intrauteriner Infektion mit dem Virus der Bovinen Virusdiarrhoe. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export