Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Phänotyp und der Funktion regulatorischer T-Zellen nach Induktion von peripherer Toleranz in einem allogenen porcinen Lungentransplantationsmodell

Thissen, Stefanie

Use of immunosuppressive drugs in solid organ transplantation is essential to prevent graft rejection but makes the patient vulnerable to infections. Graft specific tolerance without immunosuppressive side effects would be the ideal conception. Several in vitro and in vivo studies assume regulatory CD4+CD25+ T cells to induce such a tolerance. Importance of regulatory CD4+CD25+ T cells in long term surviving and rejecting lung transplanted minipigs was researched in this work. In a porcine lung transplantation model single sided lung transplantation was performed in 31 MHC and sex mismatched donor and recipient pairs. To induce tolerance different protocols were used including a 28 day course of immunosuppressive drugs supplemented with preoperative irradiation. 10 long term surviving and 21 acutely rejecting animals were periodically examined for signs of rejection and levels of regulatory T cells. Lymphocytes from peripheral blood and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were tested for different T cell subpopulations by FACS analysis. The suppressive function of CD25+ T cells was tested in a mixed lymphocyte reaction (MLR) in the presence of various antigen stimulations. Long term surviving animals (LTS) showed a noticeable percentage increase of CD4+CD25+ T cells with stable absolute cell counts in the peripheral blood 14 days after transplantation. Percentage of CD4+CD25high+ T cells quadruplicated in LTS during that time. LTS showed weakly significant higher percentages (p < 0,05) of CD4+CD25+ and CD4+CD25high+ T cells at POD70. Absolute cell counts of CD4+CD25high+ T cells increased to twice the base value and were therefore tendentially higher compared with rejecting animals at POD70. LTS showed remarkably higher percentage values of CD4+CD25high+ T cells in BALF during the whole time. Isolated CD25+ T cells in a 1:7 ratio were able to inhibit proliferation of recipient lymphocytes in MLR significantly / tendential significantly. After stimulation by donor antigen, unknown alloantigen and unspecific mitogen long term surviving and rejecting animals showed an equal inhibition to medium value. These findings implicate the importance of CD4+CD25high+ regulatory T cells for the development and maintenance of tolerance in porcine allogenic lung transplantation. High percentage numbers in peripheral blood and in the graft point to a peripheral suppression of alloreactive T cells. To get a sufficient suppression a distinct ratio of regulatory to alloreactive T cells seems to be needed. In this stage of the experiment a participation of further regulatory T cell subpopulations or other mechanisms for tolerance induction can not be excluded, because the mechanism of CD4+CD25high+ T cells remains unknown. Because of the unspecific immunosuppressive potential of these cells selective enrichment in vitro and functional tests in vivo would be a recommendable continuation. The induction protocols used failed to induce regulatory T cells reliably. The development of a dependable protocol needs further investigation to the mode of action of these cells.

In der Transplantationsmedizin stellen nach wie vor Abstoßungsreaktionen und Infektionen große Risikofaktoren für den Patienten dar. Die Immunsuppression ist eine Gratwanderung zwischen Transplantaterhaltung und Verhinderung lebensbedrohlicher Infektionen. Aufgrund ihrer großen Oberfläche ist die transplantierte Lunge besonders angreifbar für Infektionen, wodurch gerade hier eine transplantatspezifische Toleranz bei vollständiger immunologischer Kompetenz wünschenswert wäre. In vitro und in vivo Experimente lassen vermuten, dass regulatorische T-Zellen des Phänotyps CD4+CD25+ in der Lage sind, eine solche periphere transplantatspezifische Immuntoleranz zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, in welchem Maße CD4+CD25+ T-Zellen an der Transplantatakzeptanz von langzeitüberlebenden lungentranspantierten Minipigs beteiligt sind. Im Rahmen eines porcinen allogenen Lungentransplantationsmodells wurde 31 Spendern die linke Lunge entnommen und in MHC- und geschlechtsinkompatible Empfänger transplantiert. Die Toleranzinduktionsprotokolle der 10 langzeitüberlebenden und 21 abstoßenden Tiere umfassten 28 Tage lang medikamentelle Immunsuppression, teilweise kombiniert mit einmaliger präoperativer Bestrahlungstherapie. In regelmäßigen Abständen erfolgte die Untersuchung der Tiere auf Abstoßungszeichen sowie regulatorische T-Zellen. Lymphozyten aus dem peripheren Blut und der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) wurden durchflusszytometrisch untersucht, um qualitativ sowie quantitativ verschiedene T-Zellsubpopulationen zu bestimmen. Durch den Zusatz von isolierten CD25+ T-Zellen zu einer gemischten Lymphozytenkultur (MLR) wurde deren regulatorische Funktion in Gegenwart unterschiedlicher Antigenen überprüft. Die langzeitüberlebenden Tiere (LZÜ) hatten ab POD14 gegenüber den Abstoßern deutlich steigende prozentuale Anteile an CD4+CD25+ Lymphozyten im Blut bei gleich bleibenden absoluten Zellzahlen. Der Anteil an CD4+CD25high+ Lymphozyten der LZÜ erhöhte sich ab diesem Zeitpunkt auf ein Vierfaches des Basalwertes. Am POD70 waren die Anteile an CD4+CD25+ und CD4+CD25high+ Lymphozyten der LZÜ schwach signifikant höher als bei den Abstoßern. Die absolute Zahl an CD4+CD25high+ Lymphozyten stiegen bei den LZÜ auf das Doppelte des Ausgangswertes und waren damit am POD70 verglichen mit den abstoßenden Tieren tendenziell signifikant höher. In der BALF wiesen die Langzeitüberleber über den gesamten Beobachtungszeitraum deutlich höhere prozentuale Anteile an CD4+CD25high+ Lymphozyten auf. In einem Zellverhältnis von 1:7 waren isolierte CD25+ T-Zellen von beiden Gruppen in der Lage, die Proliferation von Empfängerlymphozyten gegen Spenderantigen, unbekanntes Alloantigen sowie unspezifisches Mitogen signifikant bzw. schwach signifikant bis auf den Mediumblindwert zu senken. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass CD4+CD25high+ regulatorische T-Zellen für die Entwicklung einer Transplantattoleranz in der allogenen porcinen Lungentransplantation eine entscheidende Bedeutung haben. Ihr hoher Anteil im peripheren Blut sowie im Transplantat deutet auf eine periphere Suppression von alloreaktiven T-Zellen hin. Für eine ausreichende Suppression scheint ein bestimmtes Verhältnis von regulatorischen zu alloreaktiven T-Zellen nötig zu sein. Aus den vorliegenden Versuchen kann eine Beteiligung von weiteren regulatorischen T-Zellsubpopulationen oder anderen Toleranzinduktionsmechanismen nicht ausgeschlossen werden, da die genaue Funktionsweise der CD4+CD25high+ T-Zellen nicht bekannt ist. Eine gezielte in vitro Anreicherung der regulatorischen CD4+CD25high+ Lymphozyten mit anschließendem Funktionstest in vivo wäre aufgrund der unspezifisch suppremierenden Wirkung der Lymphozyten eine sinnvolle Fortführung der Untersuchungen. Außerdem ist es mit den verwendeten Toleranzinduktionsprotokollen bisher nicht gelungen, regulatorische T-Zellen und damit Transplantattoleranz sicher zu induzieren. Die Entwicklung eines Induktionsprotokolls für regulatorische T-Zellen bedarf weiterer Erforschung ihrer Funktions- und Wirkungsweise.

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Thissen, Stefanie: Untersuchungen zum Phänotyp und der Funktion regulatorischer T-Zellen nach Induktion von peripherer Toleranz in einem allogenen porcinen Lungentransplantationsmodell. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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