Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Transduktion hämatopoetischer Stammzellen von Neuweltaffen mit Foamyviren

Wurm, Melanie

Transplantation of genetically corrected CD34+autologous hematopoietic stem cells has cured 18 out of 19 patients with severe combined immune deficiency (SCID), a hereditary disorder to which patients generally succumb in their first year of life. This clinical application of replication defective gammaretroviral vectors however induced  T cell malignancies in three children within a few years after gene therapy. For two patients, it was shown that these malignancies occurred due to insertional mutagenesis, well known for wild-type gammaretroviruses, leading to activation of cellular proto-oncogenes. Due to the recent findings that this ‘side effect’ of gammaretroviral vectors also occurred in animal models, it becomes mandatory to develop alternative vector systems that are characterized not only by their capability to transduce stem cells, but also by their high degree of safety. Prior to any clinical application, these novel vector systems have to be evaluated for safety and efficacy in a large animal model. Foamyviruses as complex retroviruses might be this candidate vector system as they are the only members of the Retroviridae that despite chronic persistent infections are non-pathogenic in animals and also humans.   In the present thesis, procedures were optimized to genetically modify autologous CD34+ cells from common marmosets (Callitrix jacchus) with the ultimate aim to re-infuse these cells to animals undergoing a mild myeloreductive treatment. Initially, the influence of different parameters like molecules of the extracellular matrix, different foamyviral envelopes and several transfection protocols on virus titers and gene transfer efficiencies was analyzed using GFP expressing foamy-, lenti- and gammaretroviral vectors. Considering the low transduction rates in animals that can be expected after reinfusion of the transduced repopulating stem cells, the second part of the thesis evaluates an in vivo selection system in hematopoeitic cell lines and marmoset CD34+ cells. This selection system is based on the P140K point mutant of the O6-methylguanin-DNA-methyltranferase chemotherapy resistant gene as transgene in foamyviral vectors in combination with the chemotherapeutic substance 1,3-bis-(2-chlorethyl)-1-Nitrosourea (BCNU).   The results demonstrated high efficacy of foamyviral vectors, processed in only 16 hours on recombinant fibronectin fragment CH296 coated plates. Genetic modification was observed in 60 % of human and 80 % of marmoset CD34+ cells, although cells were not stimulated previously. The gene transfection rate was obviously higher in foamyviruses than in gammaretroviruses; it was equal to the results from lentiviruses if these were pseudo typed by a foamyviral envelope. Contrary, the G-protein derived from the vesicular stomatitis virus (VSV-G) was insufficient when it was used as an envelope. An increase of a low transfection rate can be triggered by in vitro selection of hematopoietic cells from humans and marmosets, respectively. This was traced back to the foamyviral vectors that contain MGMTp140k and the additional treatment of cells with BCNU. In this study, foamyviral vectors were well evaluated to be very sufficient in gene transfer into human and marmoset CD34+ cells. Further applications of gene transfer into marmosets by foamyviral vectors should be tested. Phase I trials that aim at gene therapy will be sensible, if the transduction of hematopoietic stem cells is approved to be safe and efficient.  

Die Transplantation von genetisch korrigierten, CD34+ autologen hämatopoetischen Stammzellen hat 18 von insgesamt 19 Patienten mit schwerem kombiniertem Immundefekt (SCID) von ihrer, ansonsten im ersten Lebensjahr tödlich verlaufenden, hereditären Erkrankung geheilt. Dieser klinische Einsatz von replikationsdefekten gammaretroviralen Vektoren als Gentransfersystem hat allerdings einige Jahre nach der Gentherapie bei drei der Kinder zur Entstehung von T-Zell-Malignoms geführt. Bei zwei Patienten konnte gezeigt werden, dass diese Malignome durch die bei Wildtyp-Gammaretroviren bekannte Insertionsmutagenese mit Aktivierung von zellulären Onkogenen induziert worden sind. Aufgrund dieser inzwischen in verschiedenen Tiermodellen ebenfalls nachgewiesenen „Nebenwirkung“ von gammaretroviralen Vektoren ist es äußerst wichtig, alternative Vektorsysteme zu entwickeln, die nicht nur Stammzellen effektiv transduzieren können, sondern auch ein hohes Maß an Sicherheit bieten. Diese neuen Vektorsysteme müssen vor einem Einsatz beim Menschen in Großtiermodellen sicherheits- und effizienzgetestet werden. Foamyviren als komplexe Retroviren könnten ein derartiges alternatives Gentransfersystem sein, da sie als einzige Mitglieder der Retroviridae auch bei chronisch-persistierender Infektion mit keinerlei Pathogenität bei Tieren oder auch Menschen assoziiert werden konnten. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren optimiert, bei dem autologe CD34+ klonogene Zellen der Primatenspecies common marmosets (Callitrix jacchus) in vitro genetisch verändert werden, um sie dann anschließend nach milder Myeloreduktion den Tieren zurückzugeben. Initial wurden dabei verschiedene Parameter wie Einsatz von Molekülen der extrazellulären Matrix, von verschiedenen foamyviralen Hüllproteinen und Transfektionsprotokollen hinsichtlich des Einflusses auf den Virustiter und die Gentransfereffizienz mit GFP exprimierenden foamy-, lenti- und gammaretroviralen Vektoren getestet. Um die nach Reinfusion der Zellen in die Tiere zu erwartende niedrige Gentransfereffienz in repopulierende Stammzellen ausgleichen zu können, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein in vivo Selektionssytem, bestehend aus der P140K Punktmutante des Chemotherapeutikumresistenzgen O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMTp140k) als Transgen in foamyviralen Vektoren und dem Chemotherapeutikum 1,3-bis-(2-chloroethyl)-1-Nitrosourea (BCNU), an humanen hämatopoetischen Zelllinien und an CD34+ Zellen von common Marmosets getestet. Die Resultate zeigten, dass foamyvirale Vektoren in einem kurzen Transduktionsprotokoll für 16 Stunden auf dem rekombinanten Fibronektinfragment CH-296 und ohne Vorstimulation der Zielzellen mehr als 60% der humanen CD34+ Nabelschnurblutzellen und mehr als 80% der CD34+ Marmosetzellen genetisch verändern können. Diese hohe Gentransfereffizienz lag deutlich über der von gammaretroviralen Vektoren und war vergleichbar mit der von lentiviralen Vektoren, wenn letztere mit dem gleichen foamyviralen Hüllprotein pseudotypisiert wurden. Dagegen war das G-Protein des Vesicular Stomatitis Virus (VSV-G) als Hüllprotein nicht geeignet, Marmoset CD34+ Zellen mit Lentiviren effektiv zu transduzieren. Mit MGMTp140k als Transgen in zwei verschiedenen foamyviralen Vektoren war essehr gut möglich, hämatopoetische Zellen von Menschen und Marmosets in vitro mit BCNU zu selektionieren, so dass der Anteil von genetisch veränderten Zellen über die Zeit deutlich erhöht werden konnte. Mit diesen Untersuchungen konnten die Grundlagen für den Einsatz von foamyviralen Vektoren als effiziente Gentransfersysteme für die Transduktion von humanen und Marmoset CD34+ Zellen etabliert werden, so dass zur Zeit die Anwendung von foamyviralen Vektoren in Marmosets ausgetestet wird. Bei guter Verträglichkeit und effizienter Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen der Tiere wäre dann der Einsatz in klinischen Phase I-Studie beim Menschen zur Korrektur genetischer Erkrankungen möglich.  

Preview

Quote

Citation style:

Wurm, Melanie: Transduktion hämatopoetischer Stammzellen von Neuweltaffen mit Foamyviren. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export