Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Prüfung und Modulation der Typ-I-Reaktionsbereitschaft von Pferden im funktionellen in vitro Test (FIT) sowie im Intrakultantest (IKT)

Hampel, Stefan

In order to develop and examine effective ways to treat type-I-allergies reliable monitoring of type-I-effector cells, such as blood basophils and skin mast cells is essential.       The corticosteroid dexamethason is well known as symptomatic “antiallergic” drug. In an exemplar for modulation of type-I-immunreactivity horses received a single intramuscular injection of 3 mg of dexamethason / 100 kg of body weight. At different times (between 1 and 62 days) post application the influence of dexamethason on basophils was monitored ex vivo by means of their histamine release upon activation in a functional in vitro test (FIT). Contemporarily their mast cell function was assayed by means of reactive wheal formation in intradermal testings (IDT). Moreover the FIT permitted to study more direct actions of dexamethason on basophils in vitro by adding 30 ng of dexamethason per mL (corresponding to an in vivo dosis of 3 mg/100 kg) of blood from untreated horses for up to 20 h.      During these in vivo, ex vivo, and in vitro investigations on a total of 24 horses we gained two groups of results: A)        Answers to the initial questions: How can basophils be influenced by dexamethason in vitro and in vivo? Blood from untreated horses was incubated in vitro with and without dexamethason at room temperature (RT) for 2 and 20 h before the FIT assaying the basophils started. In comparison basophils from horses before and after a single treatment with dexamethason where monitored by means of the FIT ex vivo. Several results could be obtained regarding the influence of dexamethason on basophils: 1.  There was no detectable toxic or modulatory influence of dexamethason on equine basophils in vitro by means of the parameters tested. Upon incubation for 2 and 20 h at RT with and without dexamethason basophils displayed unrestricted reactivity in all setups. 2.  In vivo dexamethason had different influences on basophils: a) Temporarily it reduced the amount of blood basophils to a minimum on d2 post treatment. They returned to normal levels on d3 followed by a rebound with exaggerating basophil numbers between d4 and d12 and a subsequent regression to initial values.  b) However, up to d12 post treatment the residual basophils displayed full reactivity upon activation by antibodies. Thus, dexamethason is neither harmful to basophils (in vitro) nor does it influence their functional activity as tested in vitro and ex vivo. Killing is therefore an unlikely reason for the transient reduction of basophils upon dexamethason treatment.  c) In parallel with a return of exaggerating to initial numbers of blood basophils commencing d12 post treatment the FIT documents a clearly enhanced antibody mediated reactivity of basophils lasting at least until d 62. Thus, although without detectable influence on the function of basophils during the early period after a single treatment dexamethason seems to cause a long lasting enhancement of their reactivity from two weeks on. How can mast cells be influenced by dexamethason in vivo ? Compared to the FIT an IDT provides less differentiating information because mast cells stay in their complex environment influencing their reaction to an intradermal (i.d.) challenge all comprised by a resulting wheal. Thus, FIT results with basophils and IDT results are difficult to match in detail.  Upon a single treatment with dexamethason 1.  antibody mediated mastcell reactivity is clearly reduced already on d1 and abolished by d2, sometimes prolonged to d3. The apparent discordance to the non-impaired basophil function at the same time may be due to the fact that IDT cannot discriminate between disappearance of mast cells and reduced mast cell function. 2.  Starting from d3 or d4 post treatment antibody mediated mast cell reactivity returns but without a rebound (as seen for the number of blood basophils). Interestingly, commencing from d12 mast cell reactivity is clearly enhanced, which was still detectable by d62. 3.  The phenomenon of an enhanced antibody mediated reactivity of basophils and mast cells “late stage” after a single treatment with dexamethason was basically confirmed by histamine induced mast cell activation in the absence of antibodies. On d3 also the histamine induced mast cell reactivity was reduced but showed a remarkable rebound by d8 which was not yet back to initial levels by d62. B) Important unexpected results: We started our mast cell investigation via IDT, trusting that the frequently published procedure and evaluation of their results is well established. However, soon we had to realise that extreme qualitative and quantitative differences can be obtained by replicate injections of the same substance to one animal at the same time just at different locations. Therefore we investigated IDT in more detail with several coining results: 1.  Repeated identical injections (100 µL each) at different skin regions (“macro-areas” such as neck and shoulder) or even just a few centimetres apart “micro-regions” (skin area around a single injection side) within one “macro-area” provided very different results: from large wheals to none. This was confirmed for the control substances (phosphate buffered saline: PBS and histamine) as well as for test substances such as antibodies or antigens dissolved in PBS. Due to the fact that such locally different reactions display physiological properties of the skin, it is unacceptable to evaluate a skin reaction by comparing it to a “reference” skin reaction at another injection side. This means that presently performed IDT evaluations (reference rating) are no more acceptable and, thus, obsolete. 2.  Biologically relevant information about the reactivity of local mast cells can only be obtained by a follow up of each i.d. injection side (microarea). Therefore immediately after each local injection the diameter of the initial wheal formed exclusively by the injected volume (“volume-wheal”) must be listed before any reaction to the injected material has started. This “volume-wheal” induced and measured at time 0 is termed “0-wheal” or synonymously “starting wheal” and serves as benchmark for all further reactions at this injection side. If the local wheal increases with time a local reaction to the injected material is assumed. Therefore it is now termed “reaction wheal”. The difference in diameter between the “starting wheal” and any subsequently enlarged “reaction wheal” is termed “positive delta value” and provides the basis for the evaluation of this local skin reaction. 3.  Kinetics of „reaction wheals“ to the same substance can locally be very different and is often biphasic. Thus, for reliable results it is inevitable to follow the “starting wheal” up to 24 h post injection. Reading the results of local skin reactions at 0.5, 1, 2, 3, 4, and 24 h post injection proofed to be very informative. As locally different results to one substance can be obtained, for a reliable judgement of an individual´s reactivity to a given substance it should be administered i.d. at two skin areas (“macro-region”) and two injection sides (“micro-areas”), each. 4.  Due to the finding that about 10% of injections of mere solvent (PBS) caused unspecific “reaction wheals” lasting for several hours a new evaluation procedure was developed for IDT in horses taken into account all the findings indicated above (kinetic rating). Although kinetic rating is technically more laborious than the presently practised form of reference rating, it is clearly much more biologically relevant and reliable. Thus, for a reliable diagnostic of dermal mast cells by IDT, particularly if their modulation is to be evaluated, the kinetic rating is inevitable.

Zur Entwicklung und Prüfung einer wirksamen Typ-I-Allergietherapie ist es erforderlich, den Einfluss auf die zentralen Typ-I-Effektorzellen, die basophilen Granulozyten im Blut und die Mastzellen in der Haut, zuverlässig erfassen und beurteilen zu können.   Das Corticosteroid Dexamethason ist bekannt für seine symptomatische „antiallergische“ Wirkung. In einem Modellsystem zur Modulation der Typ-I-Reaktionsbereitschaft wurde Pferden Dexamethason in einer therapeutischen Dosis von 3 mg/100 kg Körpermasse einmalig intramuskulär verabreicht.           Zu unterschiedlichen Zeiten (zwischen 1 und 62 d) nach Applikation sollte der in vivo Einfluss von Dexamethason auf die Effektorzellen der Allergie beurteilt werden.           Dabei wurden die Basophilen ex vivo im funktionellen in vitro Test (FIT) anhand ihrer durch Aktivierung induzierten Histaminfreisetzung überprüft. Die Mastzellreaktion wurde in vivo mittels Intrakutantest (IKT) anhand der Quaddelbildung ermittelt und beurteilt. Da der FIT auch die in vitro Zugabe modulatorischer Substanzen und somit eine Prüfung deren direkter Wirkung auf die Basophilen in vitro erlaubt, wurde Blutproben unbehandelter Pferde 30 ng Dexamethason/mL Vollblut (entspricht 3 mg/100 kg KM in vivo) für bis zu 20 h zugesetzt, bevor die Reaktionsfähigkeit der Basophilen untersucht wurde.      Im Laufe dieser in vivo-, ex vivo- und in vitro-Arbeiten ergaben sich durch Untersuchungen an insgesamt 24 Pferden zwei weiterführende Ergebnisbereiche: A) Antworten auf die eingangs gestellten Fragen: Wie lassen sich Basophile von Dexamethason in vitro und in vivo beeinflussen? Mit Hilfe des FIT wurde die Anzahl basophiler Granulozyten sowie ihre spontane und induzierte Reaktionsfähigkeit anhand ihrer Histaminfreisetzung geprüft: Zum einen am Blut unbehandelter Pferde, dem für 2 oder 20 h bei RT in vitro Dexamethason zugesetzt wurde und zum anderen am Blut von Pferden, die einmalig mit Dexamethason behandelt worden waren. Daraus lassen sich folgende Aussagen zum Einfluss dieses Corticosteroids unter den hier gewählten Bedingungen treffen: 1.  Dexamethason hat in vitro weder einen toxischen noch einen erkennbaren modulatorischen Einfluss auf die hier untersuchten Parameter equiner Basophiler. Mit und ohne Dexa-methason-Zusatz zeigten die Basophilen nach 2 h und nach 20 h Inkubation uneingeschränkte Reaktionsfähigkeit in allen Kontroll- und Testansätzen. 2.  Dexamethason hat in vivo unterschiedliche Einflüsse auf equine Basophile:  a) Es reduziert ihre Anzahl temporär auf ein Minimum an d2 nach einmaliger Behandlung, gefolgt von einem Wiederanstieg ab d3, um ab d4 bis d12 auf eine deutlich erhöhte Basophilenzahl anzusteigen (rebound) und anschließend wieder auf das Niveau vor der Behandlung zurück zu gehen.  b) Bis d12 nach Behandlung ist bei den im Blut nachweisbaren Basophilen jedoch keine Einschränkung ihrer Antikörper-vermittelten Aktivierbarkeit im FIT zu erkennen. Da Dexamethason die Basophilen weder schädigt (in vitro), noch ihre nachweisbare Funktionalität beeinträchtigt (in vitro wie ex vivo), dürfte für ihr temporäres Verschwinden aus dem Blut ein Dexamethason bedingter Basophilentod auszuschließen sein.  c) Ab d12 nach Applikation ist eine deutlich erhöhte Antikörper vermittelte Reaktionsfähigkeit der Basophilen - sogar noch an d62 – festzustellen. Obwohl in den ersten 2 Wochen nach einmaliger Dexamethasongabe kein Einfluss auf die geprüfte Funktion der Basophilen erkennbar war, scheint dieses Corticosteroid ihre Reaktionsfähigkeit anschließend deutlich und lange anhaltend zu erhöhen.   Wie lassen sich Mastzellen durch Dexamethason in vivo beeinflussen? Der IKT erlaubt für die Mastzellen eine weniger differenzierende Aussage als der FIT für die Basophilen. Die funktionelle Aktivität von Mastzellen ist nur in ihrer komplexen Umgebung und deshalb nur als Resultierende aller Einflüsse und Funktionen anhand einer reaktiven Quaddelbildung zu erfassen. Deshalb ist ein detaillierter Vergleich mit dem Verhalten der Basophilen nur bedingt möglich. Nach einmaliger Dexamethasongabe 1.  ist die Antikörper vermittelte Mastzellreaktion in der Haut schon am d1 erkennbar vermindert und an d2, teils auch noch an d3, nicht mehr nachweisbar. Das erscheint als Widerspruch zu der von Dexamethason unbeeinflussten Funktionsfähigkeit der noch vorhandenen Basophilen zu gleicher Zeit im Blut. Da man im IKT jedoch nicht zwischen einer Minderung oder einem Verschwinden der Mastzellen und einer modulierten Funktionsfähigkeit der Mastzellen unterscheiden kann, könnte sich hier ein resultierender Effekt aus temporär weniger Mastzellen, aber erhaltener Funktionsfähigkeit verbergen. 2.  Ab d3 bis d4 wird die Antikörper vermittelte Mastzellreaktion im IKT wieder nachweisbar, ohne einen Reboundeffekt (wie die Anzahl der Basophilen im Blut) zu zeigen. Von besonderem Interesse ist jedoch eine deutlich gesteigerte Mastzellreaktivität ab d12, die auch noch an d62 nachgewiesen werden kann. 3.  Das Phänomen der deutlich gesteigerten - Antikörper vermittelten - „Spätreaktivität“ von Basophilen und Mastzellen nach einmaliger Dexamethasongabe in vivo wurde sogar auch für die Histamin induzierte Mastzellaktivierung – ohne nachweisbare Beteiligung von Antikörpern – beobachtet: Hier war nach einer verminderten Mastzellreaktion an d3 bereits an d8 eine deutlich über das Ausgangsniveau (vor der Behandlung) erhöhte Histamin bedingte Mastzellaktivierung messbar, die an d 62 noch immer über dem Ausgangsniveau lag. B)        Wichtige Ergebnisse, die sich unerwartet ergaben: Im Vertrauen darauf, dass der in der Literatur häufig beschriebene IKT und seine Auswertung approbierte Verfahren seien, wurden diese Untersuchungen begonnen. Da sich jedoch bald herausstellte, dass replikate Injektionen der gleichen Substanz zur gleichen Zeit am selben Tier an unterschiedlichen Hautstellen qualitativ und quantitativ extrem unterschiedliche Ergebnisse brachten, wurde der Hauttest näher analysiert. Dabei wurde deutlich, 1.  dass identische Injektionen (jeweils 100 µL) sowohl an verschiedenen Hautbereichen (Makroflächen wie Hals oder Schulter) als auch an nur wenige Zentimeter voneinander entfernten Mikroflächen (Hautbereich um die einzelne Injektionsstelle herum) zu sehr unterschiedlichen Reaktionen (keine bis sehr große Reaktionsquaddeln) führten. Das betraf sowohl die Kontrollsubstanzen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung: (PBS) und Histamin, als auch die Testsubstanzen (Antikörper und Antigene, gelöst in PBS). Auf Grund solcher – physiologisch bedingter – Unterschiede ist es nicht zu vertreten, IKT-Reaktionen an verschiedenen Injektionsstellen aufeinander zu beziehen. Damit ist die gegenwärtig häufig praktizierte Bewertung von IKT-Messungen (Referenzverfahren) hinfällig. 2.  dass nur der Verlauf an jeder einzelnen intrakutanen (i. c.) Injektionsstelle (Mikrofläche) eine biologisch relevante Aussage über die Reaktionsfähigkeit der lokalen Mastzellen erlaubt. Zu diesem Zweck ist unmittelbar nach jeder i. c. Injektion der Durchmesser der Quaddel zu erfassen, die allein durch das injizierte Flüssigkeitsvolumen („Volumenquaddel“) erzeugt wird, bevor eine Reaktion auf die injizierte Flüssigkeit auftritt. Diese zum Zeitpunkt 0 erzeugte und gemessene Quaddel wird als „0-Quaddel“ oder „Ausgangsquaddel“ bezeichnet. Sie dient als Bezugswert für jede weitere Reaktion an dieser Injektionsstelle. Sobald die Größe der Quaddel zunimmt, wird eine Reaktion auf die Injektion vermutet. Sie wird nun als „Reaktionsquaddel“ angesehen. Die Differenz im Durchmesser der „Ausgangsquaddel“ zur größeren „Reaktionsquaddel“ wird als positiver Deltawert in die qualitative Bewertung der lokalen Hautreaktion aufgenommen. 3.  Da die Kinetik der nachweisbaren lokalen Mastzellreaktion auf dieselbe Substanz in Form der „Reaktionsquaddel“ zeitlich sehr unterschiedlich und oft zweiphasig sein kann, ist es für die zuverlässige Beurteilung einer lokalen Reaktion erforderlich, den Entwicklungsverlauf einer „Ausgangsquaddel“ von einer halben bis zu 24 h zu verfolgen. Hier haben sich die Ablesezeitpunkte: 0 („Ausgangsquaddel“), 0.5, 1, 2, 3, 4 und 24 h als sehr informativ bewährt. Da lokal auf dieselbe Injektionslösung sehr unterschiedliche Reaktionen möglich sind, empfiehlt es sich für einen zuverlässigen IKT, dieselbe Lösung je an zwei Injektions-stellen („Mikroflächen“) in zwei Hautbereichen („Makroflächen“) zu platzieren. Damit wird eine weitgehend zuverlässige Aussage darüber möglich, ob die Hautmastzellen eines Tieres für eine Substanz funktionell sensibilisiert sind oder nicht. 4.  Da auch bei 10% der Lösungsmittelkontrollen (PBS-Injektionen) deutliche Reaktionsquaddeln über mehrere Stunden zu beobachten waren, wird einschließlich der Berücksichtigung solcher unspezifischer Hautreaktionen ein neues Bewertungsverfahren für den IKT bei Pferden vorgestellt, das alle die obigen Erfahrungen berücksichtigt: das Kinetikverfahren. Obwohl es den IKT einschließlich seiner neuen Auswertung in der Durchführung aufwendiger macht, ist es doch biologisch relevanter und zuverlässiger als das bisher praktizierte Referenzverfahren. Für eine zuverlässigere Diagnostik der Hautmastzellen im IKT, insbesondere wenn ihre Modulation bewertet werden soll, ist die Anwendung und Bewertung des Kinetikverfahrens unerlässlich.



Hampel, Stefan: Prüfung und Modulation der Typ-I-Reaktionsbereitschaft von Pferden im funktionellen in vitro Test (FIT) sowie im Intrakultantest (IKT). Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.


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