Population and molecular genetic analysis of primary cataracts in English Cocker Spaniels and wire-haired Kromfohrlanders

Engelhardt, Anja

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Population and molecular genetic analysis of primary cataracts in English Cocker Spaniels and wire-haired Kromfohrlanders

German
English

Der erste Ansatz der vorliegenden Studie bestand darin, systematische und genetische Effekte auf die Prävalenz häufig vorkommender Augenerkrankungen beim ein- und mehrfarbigen Englischen Cocker Spaniel (ECS) zu analysieren, Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Prävalenz und in der Entstehung der primären Katarakt in diesen beiden getrennt gezüchteten Farbvarianten des ECS zu charakterisieren und anhand der erhaltenden Ergebnisse eine Selektionsstrategie gegen die primäre Katarakt zu entwickeln. Der zweite Ansatz der Arbeit bestand darin, die genetische Grundlage dieser Erkrankung beim ECS mittels molekulargenetischer Methoden aufzuklären. Zur vergleichenden Untersuchung wurde eine weitere von der primären Katarakt betroffene Hunderasse, der rauhaarige Kromfohrländer (KFL), in die molekulargenetische Analyse miteinbezogen. Das Datenmaterial für die populationsgenetische Analyse setzte sich aus den Zuchtbuchdaten des ECS und den Untersuchungsbögen für erbliche Augenerkrankungen zusammen. Erstere wurden vom Jagdspaniel-Klub e.V., letztere vom Dortmunder Kreis (DOK) zur Verfügung gestellt. Die Schätzung genetischer Parameter erfolgte für die Merkmale primäre Katarakt (CAT), persistierende Pupillarmembran (PPM) und Distichiasis (DIST). Des Weiteren wurden anhand des Erstdiagnosealters zwei unterschiedliche altersbezogene Formen der primären Katarakt, Katarakt diagnostiziert bei Hunden bis zu 3,5 Jahren (früh-manifeste Katarakt, CAT-early) and primäre Katarakt diagnostiziert bei Hunden mit mehr als 3,5 Jahren (spät-manifeste Katarakt, CAT-late), definiert. Sowohl bei einfarbigen als auch bei mehrfarbigen ECS wurde bei etwa 50 % der Tiere bis zu einem Alter von dreieinhalb Jahren eine primäre Katarakt diagnostiziert. Ein hoher Anteil der Tiere wurde mit weniger als 4 Jahren als von primärer Katarakt betroffen diagnostiziert. Aufgrund dessen wurden die Prävalenzen von CAT, CAT-early, CAT-late, PPM und DIST als separate binäre Merkmale analysiert. Aufgrund eines Verpaarungsverbotes und eines Verwandtschaftskoeffizienten von 0,09 % zwischen ein- und mehrfarbigen Tieren wurden alle Auswertungen getrennt für diese beiden Farbvarianten durchgeführt. Die Heritabilitäten betrugen nach Transformation in ein Schwellenwertmodell h2 = 0,15 für die primäre Katarakt, 0,34 für die früh-manifeste primäre Katarakt, 0,13 für die spät-manifeste primäre Katarakt, 0,46 für PPM und 0,62 für DIST bei einfarbigen ECS und h2 = 0,06 für die primäre Katarakt, 0,13 für die früh-manifeste primäre Katarakt, 0,14 für die spät-manifeste primäre Katarakt, 0,10 für PPM und 0,61 für DIST bei mehrfarbigen ECS. Da die genetischen Korrelationen bei einfarbigen ECS nahe bei Null waren, ist davon auszugehen, dass bei dieser Farbvariante der ECS früh-manifeste Katarakt und spät-manifeste Katarakt genetisch unterschiedliche Merkmale darstellen. Ähnliches konnte bei mehrfarbigen ECS für diese beiden sich früh und spät im Leben manifestierenden Kataraktformen beobachtet werden. Die Untersuchung von Beispielpedigrees der Deutschen Population ECS wurde durchgeführt, um das familiäre Auftreten der primären Katarakt beim einfarbigen und mehrfarbigen ECS aufzuzeigen und Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Prävalenz und in der Entstehung der primären Katarakt in diesen beiden getrennt gezüchteten Farbvarianten des ECS zu charakterisieren. Das erstellte Pedigree der einfarbigen ECS berücksichtigte 40 ophthalmologisch untersuchte Tiere mit 18 nicht betroffenen und 22 betroffenen Hunden und das erstellte Pedigree der mehrfarbigen ECS 16 ophthalmologisch untersuchte Tiere mit elf nicht betroffenen und fünf betroffenen Hunden. In beiden Farbschlägen des ECS konnten unterschiedliche Formen der primären Katarakt bezüglich der Lokalisation in der Linse innerhalb eng verwandter Tiere festgestellt werden. Das Erscheinungsbild der primären Katarakt war sehr heterogen ohne offensichtliche Geschlechtsunterschiede. Die Untersuchung der erstellten Beispielpedigrees ergab keinen Hinweis auf eine familiäre Vererbung spezifischer Formen der primären Katarakt beim ECS. Des Weiteren wurden anhand der ophthalmologischen Befundbögen und der Pedigreedaten der einfarbigen ECS des Jagdspaniel-Klub e.V. Zuchtwerte für CAT und die zwei altersspezifische Formen der primären Katarakt (CAT-early und CAT-late) geschätzt, mit dem Ziel ein Selektionsprogramm gegen primäre Katarakt für den einfarbigen Englischen Cocker Spaniel zu entwickeln. Die Schätzung der Zuchtwerte wurde mittels Gibbs sampling des Programms MTGSAM durchgeführt (Van Tassell und van Vleck, 1996). Eine Beschränkung auf einfarbige ECS wurde aufgrund der Ergebnisse der vorangegangenen Schätzung genetischer Parameter für die primäre Katarakt bei ein- und mehrfarbigen ECS durchgeführt. Die geschätzten Zuchtwerte wurden auf einen Rassedurchschnitt mit einem Mittel von 100 mit einer Standardabweichung von 20 standardisiert. Der Effizienzvergleich bezüglich einer Reduzierung der Prävalenz zeigte, dass die auf den Relativzuchtwert (RZW) für früh auftretende primäre Katarakt basierende Selektion die größte Reduktion der Häufigkeiten der drei untersuchten Kataraktformen erreichte. Die Selektion basierend auf Väter- oder Mütter-RZW ≤90 für früh auftretende primäre Katarakt würde die durchschnittliche Häufigkeit dieser Erkrankung von 6,67 % auf nahezu die Hälfte reduzieren, während die Berücksichtigung von RZW ≤90 für primäre Katarakt, die durchschnittliche Häufigkeit der Population von 14,96% nur um 2,2 bis 3,6 % reduzieren würde. Dahingegen gestaltet sich die Selektion basierend auf spät auftretender primärer Katarakt aufgrund einer unzureichenden Anzahl an älteren ophthalmologisch untersuchten Tieren schwierig. Dennoch, würde der größte Selektionserfolg für die vorliegende Situation in der Deutschen Population einfarbiger Englischer Cocker Spaniels unter Berücksichtigung der Anzahl der von primärer Katarakt betroffenen Tiere erreicht werden, da eine Differenzierung der RZW aufgrund der wenig aussagekräftigen RZW für spät auftretende Katarakt in zwei unterschiedliche Altersformen weniger effizient wäre. Im Zuge der molekulargenetischen Analyse der primären Katarakt beim ECS und KFL wurden 32 mit der primären Katarakt des Menschen assoziierten Gene auf ihre potentielle Kopplung und Assoziation mit der primären Katarakt bei diesen beiden Rassen untersucht. Mittels der nicht-parametrischen Kopplungsanalyse der 45 Mikrosatelliten konnte keine signifikante Kopplung der untersuchten Mikrosatelliten mit der primären Katarakt für die beschriebenen Pedigrees des ECS und KFL festgestellt werden. Lediglich unter Berücksichtigung der Subfamilien des KFL ergab sich für PAX6 und CRYAA eine signifikante Kopplung mit der Erkrankung. Des Weiteren war die Analyse nahezu signifikant für CRYBA4, CRYBB1, CRYBB2 und CRYBB3. Mittels der daraufhin folgenden Sequenz- und Mutationsanalyse dieser Gene konnten keine SNPs (single nucleotide polymorphisms) für PAX6 und CRYBA4, allerdings insgesamt elf SNPs für CRYAA, CRYBB1, CRYBB2 und CRYBB3 gefunden werden. Keiner der identifizierten SNP zeigte eine signifikante Kopplung oder Assoziation mit der primären Katarakt. Des Weiteren wurde auch die von Mellersh et al. (2006) beschriebene kausale Mutation für die primäre Katarakt beim Staffordshire Bull Terrier und Boston Terrier weder beim ECS noch beim KFL gefunden. Hinweise auf eine mögliche Beteiligung bestimmter Gene an der primären Katarakt bei ECS und KFL sollten deshalb in weitergehenden molekulargenetischen Analysen unter Berücksichtigung eines größeren Anteils an eng verwandten, jung ophthalmologisch untersuchten Tieren verifiziert werden. Um diese hochinformativen Untersuchungsgruppen zu erhalten, sollten bereits im Zuge der offiziellen ophthalmologischen Untersuchung Blutproben genommen werden. Des Weiteren sollte im Zuge der Kataraktchirurgie Linsengewebe von Hunden gewonnen und in die molekulargenetische Analyse miteinbezogen werden.

The first purpose of the present study was to analyze systematic and genetic influences on the prevalences of frequently occurring eye diseases in single- and multi-colored English Cocker Spaniels (ECS), to characterize similarities and differences in the prevalence and formation of primary cataract (CAT) in these separately bred color variants, and to use the obtained results for developing a selection scheme against primary cataract. The second purpose of the work was to analyze the molecular genetic background of primary cataracts in ECS. For comparison purposes another dog breed, the wire-haired Kromfohrlander (KFL), known to be commonly affected by primary cataract was considered for the molecular genetic analyses. Ophthalmological records of 615 single-colored and 617 multi-colored English Cocker Spaniels bred in the German kennel club for Spaniels (Jagdspaniel-Klub e.V.) were analyzed for systematic and genetic influences on the prevalence of primary cataract (CAT), persistent pupillary membrane (PPM) and distichiasis (DIST). In refined analyses, age at first diagnosis of CAT was used to define two different age-related forms of CAT, primary cataract diagnosed in dogs of up to three and a half years of age (early onset cataract, CAT-early) and primary cataract diagnosed in dogs of more than three and a half years of age (late onset cataract, CAT-late). Almost 50 % of the affected single- and multi-colored ECS were diagnosed as affected by CAT by the age of three and a half years. A high proportion of animals were diagnosed as affected by CAT with less than four years of age. We therefore analyzed the prevalences of CAT, CAT-early, CAT-late, PPM and DIST as separate binary traits. Because the average coefficient of coancestry in all animals born after 1999 was 2.1% within the single-colored and 1.8% within the multi-colored ECS, but only 0.09% between single- and multi-colored ECS, all analyses were performed separately for single-colored and multi-colored ECS. Models for the genetic analyses were developed on the basis of the results of single and multiple analyses of variance using the GENMOD and GLIMMIX procedures of SAS (Statistical Analysis System), version 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA, 2006). Heritabilities on the underlying liability scale were 0.15 for CAT, 0.34 for CAT-early, 0.13 for CAT-late, 0.46 for PPM, and 0.62 for DIST in single-colored ECS, and 0.06 for CAT, 0.13 for CAT-early, 0.14 for CAT-late, 0.10 for PPM, and 0.61 for DIST in multi-colored ECS. We found indications for the existence of two genetically different forms of CAT with different ages of onset in single-colored ECS and a late-onset form of CAT in multi-colored ECS. Inspection of sample pedigrees of single- and multi-colored ECS affected by CAT was performed to characterize similarities and differences in the prevalence and formation of CAT in these separately bred color variants. The pedigree of the single-colored ECS included 40 ophthalmologically examined dogs with 18 unaffected and 22 affected dogs and the pedigree of the multi-colored ECS 16 ophthalmologically examined dogs with eleven unaffected and five affected dogs. In both color variants of the ECS different forms of CAT with respect to location within the lens occurred among close relatives. Appearance of cataract was very heterogeneous without obvious sex differences. The sample pedigrees did not support the assumption of familial segregation of specific forms of CAT in ECS. The results of ophthalmological examination were used for prediction of breeding values for CAT and the two different age-related forms of primary cataract, i.e. CAT-early and CAT-late, for the German population of single-colored ECS using an animal threshold model and Gibbs sampling. Breeding values were then standardized to a mean of 100 and a standard deviation of 20. Relative efficiencies in reducing prevalence of CAT and CAT-early were compared and we could show that selection based on RBV for CAT-early of both parents is expected to result in the largest relative reduction of the prevalence of all forms of CATs considered here. A selection scheme based on sires or dams with RBV for CAT-early of ≤90 would have decreased the population mean of 6.67% in the next generation by about 50%, while a selection scheme based on sires or dams with RBV for CAT of ≤90 would have decreased the population mean of 14.96% in the next generation by 2.2 to 3.6%. In contrast to these results, selection for CAT-late is difficult due to insufficient numbers of ophthalmologically examined dogs at older ages, which may be due to the management of ophthalmologically examination in the JSK. However, in the present situation the most advantageous selection strategy to reduce the prevalence of primary cataract in the German population of single-colored ECS would be to select using RBVs for CAT. For molecular genetic analyses of primary cataracts in ECS and KFL a candidate gene approach was used to investigate 32 genes, known to be associated with primary cataract in humans, for their potential linkage and association with primary cataracts in these two breeds. None of the 45 microsatellites associated with the analyzed 32 candidate genes displayed linkage with primary cataract in ECS or KFL. Tests for association revealed similar results for CRYAA in the two breeds, and we found additional significant association for MAF and SORD in the ECS and for CRYBA1 in the KFL. In addition, the causative mutation in exon 9 of canine HSF4 described by Mellersh et al (2006) in Staffordshire Bull Terriers and Boston Terriers was neither found in ECS nor in KFL. Indications of association of candidate genes should be approved by further molecular genetic analyses considering larger samples of closely related dogs ophthalmologically examined at a young age. In order to achieve these larger highly informative samples, blood samples should be collected in the course of ophthalmological examination schemes. In addition, lens tissue of dogs which underwent cataract surgery should be collected and included in the molecular genetic analyses.