Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Anpassung der Konservierungsprozesse für Hengstsperma an die Beltsville Sperm Sexing Technology

Heer, Peter

The objective of this study was to improve the cryopreservation for sex sorted stallion spermatozoa through various modifications and to evaluate these by use of current sperm analyzing methods. For this reason four test series were performed. In the first trial the use of three different antioxidants was evaluated. The second trial compared two different freezing programs and two different collection media. In both the third and the last trial a new density gradient centrifugation technique was applied and compared to common centrifugation as a tool in the preparation of stallion spermatozoa for the sex sorting process. Evaluation of sorted spermatozoa and the respective control was performed by examination of classical semen quality parameters such as morphology and progressive motility and by different flow cytometric spermatozoal quality assessments, which included protocols to determine viability and acrosome integrity, mitochondrial membrane potential and sperm chromatin structure integrity. Applied antioxidative substances (AO) of the first trial were sodium pyruvate, catalase and bovine serum albumin (BSA). These substances were added to the incubation and collection media and also to the freezing extender. Ejaculates in this trial was divided into five groups: (1) sorted with AO, (2) sorted without AO, (3) not sorted with AO, (4) not sorted without AO, (5) holding sample. Regarding the time between thawing and 10 minutes of subsequent incubation there was no significant difference in progressive motility between both frozen-thawed, sorted groups. However, motility of frozen-thawed, sorted samples decreased tremendously between 10 and 30 minutes of incubation. For this reason, only the frozen-thawed, non-sorted groups were statiscially analized from 30 until 180 minutes of incubation. Those samples extended and frozen with antioxidants added to their media showed a significantly higher progressive motility between 90 and 120 minutes of incubation compared to those which were frozen without antioxidants. The percentage of membrane damaged spermatozoa was significantly higher and additionally the percentage of viable, non-acrosome reacted spermatozoa significantly lower for sorted, frozen-thawed samples compared to non-sorted, frozen-thawed samples. However, the DNA fragmentation indices (DFI) were significantly lower for sorted , frozen-thawed samples compared to non-sorted frozen-thawed samples. Regarding flow cytometric results of frozen-thawed samples, there were no significant differences between sorted groups on the one hand or between non-sorted groups on the other. In the second trial, two different freezing programs, which only varied by their cooling rates in the range from +5°C to -6°C, and two different collection media were compared. Whereas the first program cooled with a rate of 6°C/min from +5°C to -6°C and then decreased with a rate of 60°C/min down to -155°C, the second program used a single cooling rate of 60°C/min for the whole temperature range from +5°C to -155°C. Additionally, INRA82 extender without skimmed milk and Equi Pro® Liquid Culture extender were compared for their suitability as collection media. Although there was no significant difference between the two collection media, the two stallions used in this trial showed a very different reaction to the applied colling rates. Whereas stallion 2 showed a significantly better progressive motility tested by a thermo resistance test for up to 150 minutes, for those frozen-thawed samples that were frozen by the first program, stallion 1 did only show very little difference between both programs. In the third trial an examination of a density gradient centrifugation by the use of a discontinious PureSperm® gradient was performed to validate this technique as a method to select stallion spermatozoa of high quality from the rest of the ejaculate. Results proved the PureSperm® treated samples to have higher percentages of morphologically normal spermatozoa and progressively motile spermatozoa, compared to the untreated control. Additionally, mitochondrial membrane potential was also significantly higher in PureSperm® treated samples, compared to the untreated control. The fourth trial of this study was performed to asses the suitability of the PureSperm® density gradient centrifugation technique for improving the preparation of stallion spermatozoa for the sex sorting process with subsequent cryopreservation. The new technique was compared to conventional centrifugation. Frozen-thawed samples prepared by PureSperm® density gradient centrifugation showed a significantly higher percentage of morphologically normal spermatozoa and viable, non-acrosome reacted spermatozoa as well as a signifcantly lower percentage of dead spermatozoa comared to samples that were prepared in the conventional way. In the present study, some of the evaluated modifications throughout the process of sex sorting of stallion spermatozoa with subsequent cryopreservation resulted in further improvement of the process by benefitting the quality of frozen-thawed, sex-sorted spermatozoa. While antioxidant supplementation and specific segmented cooling rates require further investigation to appoint their specific potential for an improvement of the process, the PureSperm® density gradient centrifugation technique resulted into an obvious gain in quality of frozen-thawed, sex sorted spermatozoa. This technique has proven to be applicable for implementation into the process of sex sorting of stallion spermatozoa with subsequent cryopreservation.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Kryokonservierungsverfahren für geschlechtsspezifisch sortiertes Hengstsperma durch verschiedene Modifikationen zu verbessern und durch aktuelle spermatologische Untersuchungsverfahren zu beurteilen. Zu diesem Zweck wurden vier Versuchsreihen durchgeführt. Im ersten Versuchsteil wurde der Einsatz verschiedener Antioxidantien bewertet. Der zweite Versuchsteil diente dem Vergleich zweier Auffangmedien und zweier Temperaturverläufe während der Kryokonservierung. Im dritten und vierten Versuchsteil wurde ein neues Dichtegradientenzentrifugationsverfahren getestet und mit der herkömmlichen Zentrifugation verglichen. Die Beurteilung der sortierten Spermien und der jeweiligen Kontrollen erfolgte anhand der Morphologie und der progressiven Motilität. Zudem wurden je nach Versuchsteil verschiedene flowzytometrische Verfahren zur Beurteilung der Vitalität und Akrosomenintegrität, des Mitochondrienmembranpotentials und der Spermienchromatinstrukturintegrität eingesetzt. Bei den im ersten Versuchsteil verwendeten Antioxidantien (AO) handelte es sich um Natriumpyruvat, Katalase und bovines Serumalbumin (BSA). Diese Substanzen wurden den Inkubationsmedien, den Auffangmedien und den Tiefgefriermedien zugegeben. Die Ejakulate wurde in folgende fünf Gruppen aufgeteilt: (1) sortiert mit AO, (2) sortiert ohne AO, (3) unsortiert mit AO, (4) unsortiert ohne AO, (5) Halteprobe. Im Zeitraum vom Auftauen bis 10 Minuten nach dem Auftauen war zwischen den sortierten Gruppen kein signifikanter Unterschied der progressiven Motilitäten vorhanden. Zwischen 10 und 30 Minuten nach dem Auftauen sank die Motilität der sortierten Gruppen derart stark ab, dass eine Auswertung nur noch für die unsortierten Gruppen erfolgte. Diese zeigten im Zeitraum von 90 bis 120 Minuten nach dem Auftauen signifikant höhere Motilitäten für die Gruppe mit Antioxidantien. Der Anteil PI-positiver Spermien war für die sortierten Gruppen nach dem Auftauen signifikant erhöht im Vergleich zu den unsortierten Gruppen. Der Anteil PI- und FITC-PNA-negativer Spermien, sowie die DFI-Werte waren für die sortierten Gruppen im Vergleich zu den unsortierten Gruppen signifikant erniedrigt. Ein signifikanter Unterschied zwischen den sortierten bzw. unsortierten Gruppen war für die flowzytometrischen Parameter jedoch nicht vorhanden. Im zweiten Versuchsteil wurden zwei unterschiedliche Temperaturverläufe zur Kryokonservierung und zwei verschiedene Auffangmedien miteinander verglichen. Die Temperaturverläufe unterschieden sich lediglich im Bereich von +5°C bis -6°C. Während das erste Tiefgefrierprogramm im Bereich von +5°C bis -6°C mit einer Kühlrate von 6°C/min kühlte und im Bereich von -6°C bis -155°C auf eine Kühlrate von 60°C/min umschaltete, kühlte das zweite Tiefgefrierprogramm über den gesamten Temperaturbereich von -6°C bis -155°C mit einer Kühlrate von 60°C/min. Bei den zwei Auffangmedien handelte es sich zum einen um INRA82-Verdünnermedium ohne Magermilchanteil und zum anderen um Equi Pro® Liquid Culture-Verdünnermedium. Die beiden Hengste zeigten sehr unterschiedliches Verhalten bezüglich des Temperaturverlaufs. Hengst 2 zeigte für das erste Tiefgefrierprogramm signifikant bessere Motilitätswerte im Thermoresistenztest bis zu 150 Minuten nach dem Auftauen, während Hengst 1 kaum einen Unterschied zwischen den Programmen erkennen ließ. Zwischen den Auffangmedien zeigte sich kein signifikanter Unterschied. Im dritten Versuchsteil erfolgte die Untersuchung der Dichtegradientenzentrifugation (DGZ) über einem diskontinuierlichen PureSperm®-Gradienten zur Eignung bei der Selektion qualitativ hochwertiger Hengstspermien. In diesem Versuchsteil zeigte sich eine signifikant verbesserte Morphologie, sowie signifikant höhere Motilitätswerte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Ebenso war das Mitochondrienmembranpotential der Spermien im Zentrifugat im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht. Im vierten Versuchsteil erfolgte der Einsatz der im dritten Versuchsteil getesteten DGZ bei der Aufbereitung von Hengstspermien zur geschlechtsspezifischen Sortierung mit anschließender Kryokonservierung. Es erfolgte ein Vergleich mit der herkömmlichen Aufbereitungsmethode. Die Proben, welche mittles der PureSperm®-DGZ aufbereitet worden waren, zeigten nach dem Auftauen einen signifikant höheren Anteil morphologisch unveränderter Spermien, einen signifikant niedrigeren Anteil membrangeschädigter Spermien, sowie einen signifikant höheren Anteil vitaler, nicht akrosomenreagierter Spermien im Vergleich zu jenen Proben, welche in herkömmlicher Weise aufbereitet worden waren. In der vorliegenden Arbeit konnte durch einige der untersuchten Modifikationen am Verfahren zur geschlechtsspezifischen Sortierung von Hengstspermien mit anschließender Kryokonservierung eine Verbesserung der Qualität sortierter und kryokonservierter Hengstspermien erzielt werden. Während zur Zugabe von Antioxidantien und zum segmentierten Temperaturverlauf während der Kryokonservierung weitere Untersuchungen zur genauen Bestimmung des Nutzens dieser Modifikationen erforderlich sind, konnte durch die PureSperm®-DGZ ein deutlicher Qualitätsgewinn der sortierten und kryokonservierten Spermien erreicht werden. Durch die Anwendung der PureSperm®-DGZ im Verfahren zur geschlechtsspezifischen Sortierung mit anschließender Kryokonservierung kann die Spermienqualität im Vergleich zur herkömmlichen Methode effektiv verbessert werden.

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Heer, Peter: Anpassung der Konservierungsprozesse für Hengstsperma an die Beltsville Sperm Sexing Technology. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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