Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Analysis of the canine MDR1 gene in the dog breed Elo

Fecht, Silvia

The objective of the present study was to analyse the canine MDR1 gene in the dog breed Elo for the mdr1-1Δ mutation originating in the Old English Sheepdog breed as well as to search for functional polymorphisms in the gene. A deletion mutation in the canine MDR1 gene, mdr1-1Δ mutation, was found to be the cause of multiple drug sensitivity in several dog breeds from the Collie lineage including the Old English Sheepdog breed. A haplotype of four microsatellites containing this mdr1-1Δ mutation was conserved among affected breeds. The newly developed German dog breed Elo was supposed to be affected by the mdr1-1Δ mutation because four dogs with Old English Sheepdog ancestry whose MDR1 genotypes were unknown participated in the foundation of the breed. For the analysis whether the mutant mdr1-1Δ allele is segregating in the Elo population, 177 blood samples representative for the Elo breed on the basis of gene contributions by the Old English Sheepdog founder dogs were collected. At first, a polymerase chain reaction (PCR) based method with subsequent polyacrylamide gel electrophoresis was used for the detection of the mdr1-1Δ mutation. The mdr1-1Δ allele was not observed in the analysed sample of Elos. Subsequently, the probability that no mdr1-1Δ allele originating in the Old English Sheepdog breed is segregating in the Elo population was estimated at close to one (1 - 3.68 x 10-17 » 1). Furthermore, the MDR1 flanking region of the sampled Elos was analysed using the four microsatellite markers C14.866, REN144I15, REN103E18 and G01506 to determine whether haplotypes of the Old English Sheepdog breed, which had been found to be associated with the mutant mdr1-1Δ allele, could be recovered in the Elo breed. The analysis revealed 35 different haplotypes in 177 Elo dogs. The “247-251-148-178-159” haplotype was the most frequent for the Elo breed with 31.87 %. The haplotype “247-255-148-173-159” which had previously been associated with the mutant mdr1-1Δ allele in Old English Sheepdogs was detected in the sample of Elos with a frequency of 2.26%. Using a stepwise forward/backward regression analysis for the probability of this haplotype on the proportion of genes of the founder breeds, the Old English Sheepdog could be excluded as origin of this haplotype for the Elo breed. The MDR1 flanking region could be traced back to the Japanese Spitz as one of the founder dog breeds of the Elo. Thus, we ruled out the introgression of the mdr1-1Δ mutation into the dog breed Elo through the Collie lineage. Besides the mdr1-1Δ mutation associated with multiple drug sensitivity in several dog breeds, no further sequence variations in the canine MDR1 gene have been described as yet in contrast to the numerous detected SNPs in the orthologous human MDR1 (ABCB1) gene which have partly been associated with decreased amount or functionality of the MDR1 protein (P-glycoprotein). To analyse whether functional polymorphisms exist in the exons 12, 21 and 26 of the canine MDR1 gene, sequence analysis was performed in two Collies and six dogs of the Elo breed. The analysis revealed a nonsynonymous A to G exchange in exon 26 (c.3508A>G) which causes an amino acid substitution from methionine to valine. Subsequently, restriction fragment length polymorphism (RFLP) was used for the detection of this A to G transition in 88 Elo dogs and 65 dogs of different breeds. The presence of the G-allele in the analysed Elos with a frequency of 57.95% was mainly influenced by the founder breed Samoyed. Additionally, the mutant allele was found in Labrador Retrievers, Do-Khyis, Dalmatians, German Wirehaired Pointers, Hovawarts and Border Collies. In the analysis of protein alignments used for the prediction of possible impact of the amino acid substitution on the structure and function of the protein this sequence variant was predicted to be benign. Quantitative RT-PCR revealed no significant difference between the relative expression levels of MDR1 in liver biopsies of each two Elos with the genotype A/A and G/G. Nevertheless, effects of the newly detected c.3508A>G SNP on expression, structure or functionality of MDR1 mRNA and/or protein and the presence of further functional polymorphisms in the canine MDR1 gene could not be completely excluded in this study.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, das canine MDR1-Gen bei der Hunderasse Elo auf die mdr1-1Δ-Mutation, die über den Old English Sheepdog in die Population gelangt sein könnte, sowie auf das Vorkommen funktioneller DNA-Polymorphismen zu untersuchen. Eine Deletionsmutation im caninen MDR1-Gen, die mdr1-1Δ-Mutation, verursacht multiple Arzneimittelüberempfindlichkeit bei verschiedenen Hunderassen der Collie-Linie, zu denen auch die Rasse Old English Sheepdog gehört. Der die mdr1-1Δ-Mutation umgebende Genombereich war bei den betroffenen Rassen in einem Haplotyp bestehend aus vier Mikrosatelliten konserviert. Es wurde vermutet, dass die neuentwickelte, deutsche Hunderasse Elo von der mdr1-1Δ-Mutation betroffen sein könnte, da vier Hunde mit Old English Sheepdog-Abstammung zur Gründung des Elos eingesetzt wurden. Die MDR1-Genotypen dieser vier Hunde waren nicht bekannt. Zur Untersuchung der Segregation des mutierten mdr1-1Δ-Allels in der Elo-Population wurden 177 Blutproben gesammelt, die repräsentativ für die Verteilung der Genanteile der Old English Sheepdog-Gründertiere innerhalb der Elo-Population waren. Zuerst erfolgte mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) mit anschließender Polyacrylamidgelelektrophorese die Untersuchung auf die mdr1-1Δ-Mutation. Das mdr1-1Δ-Allel wurde in der untersuchten Stichprobe von Elos nicht nachgewiesen. Anschließend wurde die Wahrscheinlichkeit, dass kein vom Old English Sheepdog stammendes mdr1-1Δ-Allel in der aktuellen Elo-Population segregiert, auf annähernd Eins (1 - 3,68 x 10-17 » 1) geschätzt. Weiterhin erfolgte die Analyse des den MDR1-Locus umgebenden Genomabschnitts bei den beprobten Elos mit Hilfe der vier Mikrosatellitenmarker C14.866, REN144I15, REN103E18 und G01506 um zu ermitteln, ob Haplotypen der Old English Sheepdog-Rasse, die bereits mit dem mutierten mdr1-1Δ-Allel assoziiert wurden, in der Rasse Elo wiedergefunden werden könnten. Es ergaben sich 35 verschiedene Haplotypen bei den untersuchten 177 Elos. Am häufigsten war der Haplotyp „247-251-148-178-159“ mit einer Frequenz von 31,87%. Es wurde ein Haplotyp „247-255-148-173-159“ in der Stichprobe mit einer Frequenz von 2,26% gefunden, der bei Old English Sheepdogs mit dem mutierten mdr1-1Δ-Allel assoziiert war. Mittels Regressionsanalyse erfolgte schrittweise die Ermittlung des Zusammenhangs zwischen den Genanteilen der verschiedenen Gründerrassen bei den untersuchten Elos und dem Auftreten dieses Haplotyps. Dabei wurde die Rasse Old English Sheepdog als Ursprung dieses Haplotyps bei der Rasse Elo ausgeschlossen und die MDR1 flankierende Region auf den Japanspitz als eine der Gründerrassen des Elo zurückgeführt. Somit konnte die Einkreuzung der mdr1-1Δ-Mutation über die Collie-Linie in die Rasse Elo ausgeschlossen werden. Neben der mdr1-1Δ-Mutation, die mit multipler Arzneimittelüberempfindlichkeit bei mehreren Hunderassen assoziiert ist, wurden bis jetzt in der Literatur noch keine weiteren Sequenzvarianten im MDR1-Gen des Hundes beschrieben. Im Gegensatz dazu wurden im orthologen humanen ABCB1 (MDR1)-Gen zahlreiche Einzelnucleotidpolymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) beschrieben, die teilweise mit Veränderungen der Menge oder Funktionalität des MDR1-Proteins (P-Glykoprotein) in Zusammenhang gebracht wurden. Zur Untersuchung des Vorkommens funktioneller Polymorphismen in den Exons 12, 21 und 26 des caninen MDR1-Gens erfolgte eine Sequenzanalyse bei zwei Collies und sechs Elos. Die Analyse zeigte einen nichtsynonymen Basenaustausch von A zu G im Exon 26 (c.3508A>G), der einen Aminosäureaustausch von Methionin zu Valin verursacht. Anschließend wurde ein Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) benutzt, um diesen Basenaustausch bei 88 Elos und 65 Hunden verschiedener Rassen zu untersuchen. Das Vorkommen des G-Allels bei den untersuchten Elos mit einer Frequenz von 57,95% wurde hauptsächlich durch die Gründerrasse Samojede beeinflusst. Das mutierte Allel konnte außerdem bei Hunden der Rassen Labrador Retriever, Do-Khyi, Dalmatiner, Deutsch Drahthaar, Hovawart und Border Collie nachgewiesen werden. Mittels Aminosäuresequenzvergleichen wurden mögliche Auswirkungen des Aminosäureaustauschs auf die Struktur und Funktion des Proteins prognostiziert. Die gefundene Sequenzvariante konnte dabei als gutartig eingestuft werden. Die Messung der relativen Expressionshöhen von MDR1 in Leberbiopsien von je zwei Elos mit dem A/A- und dem G/G-Genotyp mittels quantitativer RT-PCR ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Genotypen. Nichtsdestotrotz können durch diese Studie Auswirkungen des neu entdeckten c.3508A>G SNPs auf die Expression, Struktur oder Funktionalität der MDR1-mRNA und/oder des Proteins sowie das Vorkommen weiterer funktioneller Polymorphismen im caninen MDR1-Gen nicht vollständig ausgeschlossen werden.

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Fecht, Silvia: Analysis of the canine MDR1 gene in the dog breed Elo. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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