Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss und Wirkung des Gestagens Delmadinonacetat auf den neuronalen GABA- und Glycin-Rezeptor

Derks, Katrin Anke

In Germany, a high percentage of referring veterinarians use the synthetic gestagen Delmadinone acetate as anticonvulsive treatment or add on medication in epileptic dogs because of anecdotical reported success. Up to now there have been no experimental studies on the neurophysiological effects of delmadinone (D.A.) on neuronal ion channels which could support the proposed effect of the substance for seizure control. Therefore, the functional effects of D.A. on ligand gated inhibitory ion channels were evaluated in an in vitro model using a heterologous cell system (human embryo kidney cells) for expression of human neuronal Gamma-Aminobutyric Acid- (GABAAα1ß2γ2) or human Glycine (α1)-Receptors. Co-application patch-clamp measurements of the agonists (3 µM GABA or 10 µM Glycine) in combination with different concentrations of D.A. (1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM and 60 µM) were performed. Recordings were carried out in the whole-cell configuration on 15 cells expressing GABAA receptors and on 6 cells with Glycine receptors. The saturating concentration of the respective agonist (1 mM) was used as an internal control. The changes of the maximum peak amplitude between this control and the application of D.A. were expressed as relative amplitudes for statistical analysis of the functional effects of D.A.. An additional positive control was the application of 100 µM progesterone (prog.), a well characterized neurosteroid with an enhancing influence on maximum peak amplitudes of GABAA-receptors (n = 9). The relative amplitudes of the experiments are summarized in the table below. Applied Substance(s) Mean of rel. Amplitudes Standard Error of Mean 3 µM GABA 0.20 0.03 1–60 µM D.A.+ 3 µM GABA 0.17–0.2 0.03–0.04 100 µM prog. + 3 µM GABA 0.33 0.08 10 µM Glycine 0.16 0.06 1–60 µM D.A. + 10 µM Glycine 0.13–0.19 0.05–0.06 The statistical analysis of the relative amplitudes demonstrated neither for the GABAA- nor for the Glycine-receptor a significant influence of different concentrations of D.A., whereas the progesterone application showed a significant increased influence on the GABAA-receptors. In addition to the maximum peak amplitudes the last part of the curves, known as deactivation, were examined by describing the time-constant τ. Both receptors showed a monoexponential fit, with 6 cells for the Glycine- and 5 cells for the GABAA-receptor experiments. Even in this part of the study could no significant effect be mentioned through D.A.. The last analysis was performed on the relative area under the curve (AUC), where 3 of the 5 D..A. concentrations showed a significant decrease. But nevertheless the relative AUC of the highest concentration D.A. (60 µM, 0,24  ± 0,05, n = 15) almost  reached the result for the 3 µM  GABA-control (0,29 ± 0,04) again. At the Glycine-receptor the results for the relative AUC ranged from 0,02 to 0,08. These results indicate that there is neither an activating nor an inhibiting influence of D.A. on the two inhibitory ligand gated ion channels. Delmadinone acetate has in contrast to other neurosteroids no direct functional effect on the evaluated neuronal ion channels and cannot be considered to be a useful anticonvulsive substance.

In Deutschland wird, auf Grund von mündlich überliefertem Therapieerfolg, von überweisenden Tierärzten häufig das synthetische Gestagen Delmadinonacetat (D.A.) bei Hunden mit epileptiformen Anfällen verwendet. Bis zum heutigen Zeitpunkt existieren keine Studien, die die neurophysiologische Wirkung von D.A. an neuronalen Rezeptoren untersuchen und den beschriebenen Effekt bei der Epilepsie-Therapie bestätigen. Aus diesem Grund wurden in vorliegender Arbeit mögliche Effekte von D.A. an inhibitorischen neuronalen Ionenkanälen getestet. Als Studien-Modell dienten HEK (human embryonic kidney) 293-Zellen, eine heterologe Zelllinie, die Rezeptoren transient exprimiert. Es wurden der humane α1ß2γ2GABAA-Rezeptor und der humane α1Glycin-Rezeptor durch Transfektion auf den Zellen exprimiert und in Patch-Clamp-Experimenten untersucht. Dabei wurde in Co-Applikation der jeweilige Agonist (3 µM GABA bzw. 10 µM Glycin) mit fünf  Konzentrationen  D.A. in einer aufsteigenden  Konzentrationsreihe  (1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 60 µM) getestet. Als interne Kontrolle diente die sättigende Konzentration von 1 µM des jeweiligen Agonisten. Sättigend bedeutet in diesem Fall das Auslösen einer maximalen Stromantwort mit einer charakteristischen Kurvenform. Alle Experimente wurden in der Whole-Cell-Konfiguration durchgeführt. Für die Untersuchung der Spitzenstromamplitude flossen am GABAA-Rezeptor 15 Zellen, am Glycin-Rezeptor 6 Zellen in die Auswertung ein. Die Veränderungen der Spitzenstromamplitude zwischen der 1 mM-Kontrolle und den Testlösungen wurden zur Analyse eines Delmadinon-Effekts als relative Amplitude dargestellt und  statistisch  analysiert. Als  zusätzliche  Positivkontrolle diente die  Co-Applikation  von 100 µM Progesteron am GABAA-Rezeptor (n = 9). Progesteron ist ein bereits gut untersuchtes Neurosteroid mit einem sicheren potenzierenden Einfluss auf die GABAerge Wirkung am Rezeptor. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der relativen Amplituden an beiden Rezeptoren zusammengefasst dargestellt. Applizierte Substanze(n) Mittelwert der rel. Amplituden Standardabweichung des Mittelwertes 3 µM GABA 0.20 0.03 1–60 µM D.A.+ 3 µM GABA 0.17–0.2 0.03–0.04 100 µM Prog. + 3 µM GABA 0.33 0.08 10 µM Glycin 0.16 0.06 1–60 µM D.A. + 10 µM Glycin 0.13–0.19 0.05–0.06   Die statistische Analyse der erhobenen Daten zeigt bei Betrachtung der relativen Amplitude weder für den GABAA- noch für den Glycin-Rezeptor einen signifikanten Einfluss durch D.A. in den getesteten Konzentrationen. Im Gegensatz dazu ist bei Applikation von Progesteron ein signifikant positiver Einfluss am GABAA-Rezeptor zu verzeichnen. Neben der Spitzenstromamplitude wurde an den Stromkurven der Abschnitt der Deaktivierung anhand der Zeitkonstante τ näher untersucht, die das Zurückkehren des Rezeptors in den Ausgangszustand beschreibt. Bei beiden Rezeptoren konnte die Deaktivierung durch eine monoexponentielle Funktion beschrieben werden, und bei 6 gemessenen Zellen am Glycin- und 5 Experimenten am GABAA-Rezeptor war insgesamt betrachtet kein signifikanter Effekt durch D.A. zu beobachten. Als letzter Parameter wurde die relative area under the curve untersucht, am GABAA-Rezeptor existierte ein signifikanter Unterschied bei drei von fünf Konzentrationsstufen, allerdings war die höchste Delmadinonkonzentration mit einer relativen AUC von 0,24 annährend gleich groß wie die 3 µM GABA-Kontrolle mit 0,29. Am Glycin-Rezeptor bewegten sich die Werte für die relative AUC in der Verdünnungsreihe zwischen 0,08 und 0,02. Diese Resultate zeigen insgesamt, dass weder ein aktivierender noch ein inhibitorischer Effekt von D.A. an den zwei untersuchten inhibitorischen ligandenaktivierten Ionenkanälen beobachtet werden kann. Aus diesem Grund kann festgestellt werden, dass D.A. keine funktionelle Wirkung am GABAA- und am Glycin-Rezeptor hat und deshalb nicht als antikonvulsiv wirkende Substanz bezeichnet werden kann.  

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Derks, Katrin Anke: Einfluss und Wirkung des Gestagens Delmadinonacetat auf den neuronalen GABA- und Glycin-Rezeptor. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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