Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zu minimalen Hemmkonzentrationen von antimikrobiellen Wirkstoffen gegenüber bovinen Mastitiseregern

Brix, Asmien Christiane

The inflammation of the udder is one of those dairy cows’ diseases with most economical impact and great relevance for food hygiene. A sound microbiological pathogen diagnosis is a prerequisite for an effective therapy just as the testing for in vitro susceptibility towards antimicrobial drugs, yielding quantitative results. In order to categorize minimum inhibitory concentrations (MIC) as “susceptible”, “intermediate”, and “resistant”, it is necessary to establish valid thresholds for veterinary medicine concerns. These breakpoints are are based on data of pharmacokinetics, bioavailability, toxicity, and results from clinical and microbiological trials (MIC) of these antiinfectives. The goal of the present work was to determine meaningful values regarding in vitro concentrations of inhibitor substances in antimicrobial drugs and their combinations to eliminate pathogens of bovine mastitis. The samples comprised a total of 808 pathogen strains (105 Staphylococcus [S.] aureus, 100 coagulase-negative staphylococci, 110 Streptococcus [S.] uberis, 89 S. dysgalactiae, 44 S. agalactiae, 75 Enterococcus spp., 103 Arcanobacterium pyogenes, 106 Escherichia coli, 76 Klebsiella spp.), isolated from mastitic milk between January 2005 and December 2006 at the Institute of Food Quality and Food Safety. The selection of both pathogens and antimicrobial drugs (cefquinome, cefazolin, cefoperazone, ampicillin, oxacillin, penicillin/framycetin, erythromycin, enrofloxacin and trimethoprim/sulfamethoxazole) surveyed here was based on the lack of valid MIC breakpoints for the indication “mastitis” and usage of these substances within common bovine practice. MIC testing was performed by microdilution broth method, following the indications by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Identification of pathogens was done using biochemical profiles by means of API test systems. A reliable diagnosis of Klebsiella spp. could be established at genus level only. Suspicions regarding an ambiguity in those 75 pathogens identified previously as enterocci were confirmed by the distribution of MIC values and an analysis of rRNA sequences: this subgroup in fact comprised two genera, i.e. Enterococcus spp. (n = 49) and Lactococcus spp. (n = 26). During MIC testing, the lactococci proved to be much more susceptible towards the antimicrobial drugs than the enterococci. The drug combination trimethoprim/sulfamethoxazole yielded an extensive in vitro efficacy. MIC50 and MIC90 values ranged ≤ 0.125 mg/L and ≤ 0.5 mg/L in all pathogens, resp. Regarding Gram-positive pathogens (except enterococci), penicillins (MIC50 ≤ 0.25 mg/L, MIC90 4 mg/L) and cefquinome (MIC50 ≤ 0.5 mg/L, MIC90 ≤ 1 mg/L) showed very good results. Cefquinome (MIC50 ≤ 0.063, MIC90 ≤ 0.125 mg/L), trimethoprim/sulfamethoxazol (MIC50 ≤ 0.063, MIC90 ≤ 0.25 mg/L), and enrofloxacin (MIC50 ≤ 0.063, MIC90 ≤ 0.125 mg/L) were most effective towards Gram-negative pathogens. Expectedly, all penicillins (except penicillin/framycetin MIC50 ≤ 1 mg/L, MIC90 ≤ 2 mg/L) yielded satisfactory results in higher concentrations or did not yield any results at all. The present survey points out S. dysgalactiae to be the most susceptible mastitis pathogen. Four drugs were able to inhibit growth of nearly 100% of this species’ strains already at the lowest concentration level. Enterococci, however, proved to be the most resistant genus, and only the combination trimethoprim/sulfamethoxazole was able to inhibit the growth of strains at low concentrations (MIC50 0.063 mg/L; MIC90 0.5 mg/L), respectively. In general, MIC values determined in this survey corresponded with the results obtained in other studies, among them those of the resistance monitoring study performed by the BVL, the German Federal Office of Consumer Protection and Food Safety. Therefore the data provide valuable epidemiologic contributions for the evaluation of the in vitro susceptibility of bovine mastitis pathogens.

Zu den wirtschaftlich und lebensmittelhygienisch bedeutendsten Erkrankungen der Milchkuh gehört die Entzündung der Milchdrüse. Eine Voraussetzung für eine effektive Therapie ist die mikrobiologische Erregerdiagnostik und die In-vitro-Empfindlichkeitstestung gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen (möglichst in Form quantitativer Ergebnisse). Zur Einstufung minimaler Hemmkonzentrationen (MHK) in die Kategorien „sensibel“, „intermediär“ und „resistent“ sind valide veterinärmedizinische Grenzwerte erforderlich. Die Festlegung dieser erfolgt mittels Daten zur Pharmakokinetik, Bioverfügbarkeit und Toxizität sowie Befunden von klinischen und mikrobiologischen (MHK) Prüfungen der Antiinfektiva. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Ermittlung aussagefähiger In-vitro-Werte zu minimalen Hemmkonzentrationen antimikrobieller Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen gegenüber bovinen Mastitiserregern. Insgesamt wurden von Januar 2005 bis Dezember 2006 im Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit 808 Mastitiserreger (105 Staphylococcus [S.] aureus, 100 koagulasenegative Staphylokokken, 110 Streptococcus [S.] uberis, 89 S. dysgalactiae, 44 S. agalactiae, 75 Enterococcus spp., 103 Arcanobacterium pyogenes, 106 Escherichia coli, 76 Klebsiella spp.) aus bovinen Mastitismilchproben isoliert. Die Auswahl der Mastitiserreger und der antimikrobiellen Wirkstoffe (Cefquinom, Cefazolin, Cefoperazon, Ampicillin, Oxacillin, Penicillin/Framycetin, Erythromycin, Enrofloxacin und Trimethoprim/Sulfamethoxazol) richtete sich nach fehlenden validen MHK-Grenzwerten für die Indikation „Mastitis“ und wurde außerdem durch den Einsatz dieser Wirkstoffe in der kurativen Rinderpraxis beeinflusst. Die MHK-Untersuchung erfolgte mittels Bouillonmikrodilution nach den Vorgaben des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Mit Hilfe von API-Testsystemen wurde eine Überprüfung biochemischer Merkmale zur Erregerdifferenzierung durchgeführt. Die Klebsiellen konnte dabei nur auf Gattungsebene sicher diagnostiziert werden. Anhand der MHK-Verteilung und einer abschließenden DNA-Sequenzanalyse bestätigte sich der Verdacht, dass es sich bei den 75 zunächst als Enterokokken identifizierten Erregern, um zwei verschiedene Gattungen handelte (n = 49 Enterococcus spp.; n = 26 Lactococcus spp.). Die Laktokokken zeigten sich im Gegensatz zu den Enterokokken in der MHK-Untersuchung als wesentlich empfindlicher gegenüber den geprüften antimikrobiellen Wirkstoffen. Die Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol zeigte in vitro eine umfassende Wirksamkeit. Bei allen Erregern lagen die MHK50 bei ≤ 0,125 mg/L und die MHK90 bei ≤ 0,5 mg/L. Hinsichtlich der grampositiven Erreger (mit Ausnahme der Enterokokken) waren die geprüften Penicilline (MHK50 ≤ 0,25 mg/L, MHK90 4 mg/L) sowie Cefquinom (MHK50 ≤ 0,5 mg/L, MHK90 ≤ 1 mg/L) sehr gut wirksam. Gegenüber den gramnegativen Erregern zeigten sich wiederum Cefquinom (MHK50 ≤ 0,063 mg/L, MHK90 ≤ 0,125 mg/L), Trimethoprim/Sulfamethoxazol (MHK50 ≤ 0,063 mg/L, MHK90 ≤ 0,25 mg/L) und Enrofloxacin (MHK50 ≤ 0,063 mg/L, MHK90 ≤ 0,125 mg/L) als am wirksamsten. Unter den Penicillinen (bis auf die Wirkstoffkombination Penicillin/Framycetin, MHK50 ≤ 1 mg/L, MHK90 ≤ 2 mg/L) wirkten erwartungsgemäß erst höhere bzw. keine der geprüften Konzentrationen. Die Spezies S. dysgalactiae wurde in der vorliegenden Arbeit als empfindlichster Mastitiserreger ermittelt. Bei vier Wirkstoffen wurden nahezu 100% der S. dysgalactiae-Stämme bereits von der jeweils niedrigsten Konzentrationsstufe gehemmt. Die Enterokokken erwiesen sich am unempfindlichsten; nur die Kombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol konnte alle geprüften Isolate in einem niedrigen Konzentrationsbereich hemmen (MHK50 0,063 mg/L; MHK90 0,5 mg/L). Die ermittelten MHK-Werte deckten sich im Allgemeinen mit den Ergebnissen anderer Studien, darunter die des nationalen Resistenzmonitorings des BVLs. Die Daten liefern somit einen umfassenden Beitrag zur Beurteilung der In-vitro-Empfindlichkeit von bovinen Mastitiserregern.

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Brix, Asmien Christiane: Untersuchung zu minimalen Hemmkonzentrationen von antimikrobiellen Wirkstoffen gegenüber bovinen Mastitiseregern. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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