Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

The liver phase of malaria infection

Bär, Kerstin

Malaria remains one of the leading public health challenges mankind is facing today. An infection in the mammalian host is initiated when Plasmodium sporozoites are inoculated into the skin through the bite of an infected female Anopheles mosquito. The parasites then enter a blood vessel and travel with the bloodstream to the liver, their initial site of replication. The exact route that malaria sporozoites take to invade hepatocytes has been subject of extensive discussion. Previous studies suggest that sporozoites cross the sinusoidal cell barrier by passing through Kupffer cells, the resident macrophages of the liver, but interpretation of these results was hampered by various factors and proof has been elusive. One aim of this thesis was to determine the role of Kupffer cells as potential entrance gates for Plasmodium yoelii sporozoites to the liver. Two different mouse models were used to achieve this goal: 1) Op/op mice, which have 77% fewer Kupffer cells in relation to their phenotypically normal +/? littermates, and 2) mice treated with liposome-encapsulated clodronate, which completely eliminates Kupffer cells from the liver. A novel quantitative reverse transcription polymerase chain reaction assay for P. yoelii 18S rRNA revealed an 84% reduced liver infection rate in op/op mice compared to control littermates. In contrast, infection with P. yoelii was enhanced seven- to 15-fold in clodronate-treated mice. The discrepancy between these two mouse models was explained by electron microscopy showing temporary discontinuities in the sinusoidal cell layer caused by clodronate treatment. Thus, Kupffer cell deficiency in op/op mice reduces sporozoite infection by diminishing the number of portals to the liver parenchyma, whereas clodronate increases sporozoite infection by opening portals and providing sporozoites direct access to hepatocytes. Together these data provide strong support that Kupffer cell passage is obligatory for Plasmodium infection of the liver. After successful hepatocyte invasion, sporozoites develop to large exo-erythrocytic forms (EEF) which eventually differentiate to thousands of erythrocyte infective merozoites. These merozoites are released into the bloodstream and cause the typical symptoms of a malaria infection. EEFs are key vaccine and drug targets but until recently, morphological analysis of Plasmodium growth and development in the liver was restricted to post-mortem investigations and in vitro studies. The second focus of this thesis was to characterize the process of EEF maturation and the mechanism of merozoite release in vivo. Intravital microscopy of GFP-expressing P. yoelii parasites showed that merozoites are predominantly released from infected hepatocytes as merosomes, packets of dozens to hundreds of parasites enveloped by host cell membrane. Merosomes exit the liver intact, adapt a relatively uniform size and accumulate in the lungs. The pulmonary microvasculature effectively cleared merosomes from the bloodstream and no large parasite aggregates were found in blood harvested from the tail vein or the left heart or in any of the major organs. Characterization of isolated extrahepatic merosomes with apoptotic markers, membrane dyes and nucleic acid stains revealed that merosomes have an intact membrane and contain viable merozoites. Evidence of merosomal merozoite infectivity was provided by hepatic effluent containing merosomes being significantly more infective than blood with an identical low-level parasitemia. After being arrested inside lung capillaries, merosomes eventually disintegrated thus liberating merozoites into the bloodstream. This previously unrecognized phase of the Plasmodium life cycle is considered advantageous for the parasite, because the low intravascular macrophage density and the reduced blood velocity in the lung very likely enhance the ability of merozoites to successfully invade erythrocytes. Together, these findings suggest that Plasmodium has acquired yet another mechanism to evade the hosts’ immune system: merosomes protect merozoites from phagocytosis and safely shuttle them out of the liver, thus ensuring an effective transition from the silent liver to the clinically symptomatic blood phase of the malaria infection.

Malaria ist eine der weltweit bedeutendsten Infektionserkrankungen, an deren Folgen bis zu 3 Millionen Menschen jährlich sterben, zum größten Teil Kinder. Der Erreger, ein einzelliger Parasit  (Plasmodium), wird durch den Stich einer weiblichen Anopheles Mücke in die Haut übertragen. Die sogenannten Sporozoiten gelangen dann mit dem Blutstrom in die Leber, wo sie sich festsetzen und in Hepatozyten zu Leber-Schizonten weiterentwickeln. Um Hepatozyten infizieren zu können, müssen die Parasiten eine kontinuierliche Schicht aus Endothel- und Kupfferzellen durchdringen, die zusammen mit dem Disse’schen Raum die Leberzellen vom Blutstrom abtrennt. Die Ergebnisse mehrerer Studien ließen es wahrscheinlich erscheinen, dass Sporozoiten mittels Passage durch Kupfferzellen in das Leberparenchym eindringen, aber ein eindeutiger Beweis für diese besondere Funktion dieser stationären Lebermakrophagen während einer Plasmodium-Infektion konnte bisher nicht erbracht werden. Ein Ziel dieser Dissertation war es daher, die Hypothese, dass Kupfferzellen als Eintrittspforte für Sporozoiten fungieren können entweder zu bestätigen oder zu widerlegen. Hierzu wurden zwei unterschiedliche Mausmodelle verwendet: 1) Op/op Mäuse, die 77% weniger Kupffer-Zellen besitzen als phenotypisch normale +/? Nachkommen des gleichen Wurfes, und 2) Mäuse, deren Kupfferzellen durch Behandlung mit Clodronat-Liposomen kurz vor einer Infektion entfernt wurden. Clodronat eliminiert die gesamte Kupfferzell-Population der Leber, da es nach Phagozytose zur selektiven Induktion der Apoptose in diesen Makrophagen kommt. Die Quantifizierung von P. yoelii 18S rRNA in der Leber mittels eines neuen Real-Time PCR Ansatzes ergab, dass die Infektionsrate in op/op Mäusen im Vergleich zu +/? Kontrollmäusen deutlich (84%) reduziert war, während die Infektionsrate nach Clodronatbehandlung 7 bis 15-fach erhöht war. Weiterführende elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Eliminierung von Kupfferzellen durch Clodronat Lücken im Endothel hinterlässt, welche den Parasiten vereinfachten Zugang zu Hepatozyten gewähren. Die Verminderung der Kupfferzell-Zahl bei gleichzeitig intakter sinusoidaler Zellbarriere in op/op Mäusen hingegen reduziert die Eintrittsmöglichkeiten für Sporozoiten in das Leberparenchym. Gemeinsam betrachtet belegen diese Daten, dass Kupfferzellen eine Schlüsselrolle bei der Etablierung einer Malariainfektion besitzen. Nach der Invasion eines Hepatozyten entwickeln Sporozoiten sich weiter zu Leberschizonten, sogenannten exo-erythrozytären Formen (EEF), die sich schließlich zu mehreren tausend Merozoiten differenzieren. Jeder dieser Merozoiten ist in der Lage, einen Erythrozyten zu infizieren. Die sich wiederholende synchrone Schizogonie in Blutzellen verursacht dann die typischen Malaria-Symptome. Leberstadien sind deshalb ideale Ansatzpunkte für eine erfolgreiche Medikamenten- und Impfstoffentwicklung, da sie den Übergang zu den pathogenen Blutstadien bilden. Die bisherige Charakterisierung der EEF war beschränkt auf die Analyse von post-mortem Gewebeproben oder in vitro Studien. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit war daher, den Mechanismus der Merozoitenfreisetzung aus den EEF ins Blut in vivo zu bestimmen. Hierzu wurden Mäuse mit fluoreszierenden P. yoelii Sporozoiten (PyGFP) infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie untersucht. Merozoiten wurden nicht, wie ursprünglich vermutet, durch Ruptur der Hepatozyten-Membran einzeln in den Blutstrom entlassen, sondern in Form von Wirtszellmembran-umhüllten Paketen, so genannten Merosomen. Überraschenderweise werden Merosome mit dem Blutstrom intakt aus der Leber heraus und in die Lunge transportiert, wo sie im pulmonalen Kapillarnetz akkumulierten. Die Charakterisierung von isolierten extrahepatischen Merosomen mit diversen Membran-, Apoptose- und DNA-Markern ergab, dass Merosome eine intakte Membran besitzen und vitale Merozoiten enthalten. In einem weiteren Versuch wurde die Infektiosität der merosomalen Merozoiten gezeigt, indem Leber-Blut, dass zusätzlich zu infizierten Erythrozyten Merosomen enthielt, signifikant infektiöser war als Schwanzvenen-Blut mit der gleichen Parasitämie, aber ohne Merosomen. Nachdem die Merosomen sich in der Lunge festgesetzt hatten, erfolgte die Freisetzung der Merozoiten durch Disintegration der sie umschließenden Membran. Dies wird als bisher unbekannter Evasionsmechanismus von Plasmodium interpretiert: Durch Freisetzung der Parasiten im Kapillargebiet der Lunge können Merozoiten der phagozytischen Elimination durch Kupfferzellen in der Leber entgehen, da sie wegen der Umhüllung von Wirtszell-Membran vom Immunsystem des Wirtes nicht erkannt werden können. Außerdem ist es möglich, dass der reduzierte Blutfluss und die geringere Makrophagendichte der Lungenkapillaren von Vorteil für die Invasion von Erythrozyten ist.

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Bär, Kerstin: The liver phase of malaria infection. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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