The liver phase of malaria infection

Malaria ist eine der weltweit bedeutendsten Infektionserkrankungen, an deren Folgen bis zu 3 Millionen Menschen jährlich sterben, zum größten Teil Kinder. Der Erreger, ein einzelliger Parasit  (Plasmodium), wird durch den Stich einer weiblichen Anopheles Mücke in die Haut übertragen. Die sogenannten Sporozoiten gelangen dann mit dem Blutstrom in die Leber, wo sie sich festsetzen und in Hepatozyten zu Leber-Schizonten weiterentwickeln. Um Hepatozyten infizieren zu können, müssen die Parasiten eine kontinuierliche Schicht aus Endothel- und Kupfferzellen durchdringen, die zusammen mit dem Disse’schen Raum die Leberzellen vom Blutstrom abtrennt. Die Ergebnisse mehrerer Studien ließen es wahrscheinlich erscheinen, dass Sporozoiten mittels Passage durch Kupfferzellen in das Leberparenchym eindringen, aber ein eindeutiger Beweis für diese besondere Funktion dieser stationären Lebermakrophagen während einer Plasmodium-Infektion konnte bisher nicht erbracht werden. Ein Ziel dieser Dissertation war es daher, die Hypothese, dass Kupfferzellen als Eintrittspforte für Sporozoiten fungieren können entweder zu bestätigen oder zu widerlegen. Hierzu wurden zwei unterschiedliche Mausmodelle verwendet: 1) Op/op Mäuse, die 77% weniger Kupffer-Zellen besitzen als phenotypisch normale +/? Nachkommen des gleichen Wurfes, und 2) Mäuse, deren Kupfferzellen durch Behandlung mit Clodronat-Liposomen kurz vor einer Infektion entfernt wurden. Clodronat eliminiert die gesamte Kupfferzell-Population der Leber, da es nach Phagozytose zur selektiven Induktion der Apoptose in diesen Makrophagen kommt. Die Quantifizierung von P. yoelii 18S rRNA in der Leber mittels eines neuen Real-Time PCR Ansatzes ergab, dass die Infektionsrate in op/op Mäusen im Vergleich zu +/? Kontrollmäusen deutlich (84%) reduziert war, während die Infektionsrate nach Clodronatbehandlung 7 bis 15-fach erhöht war. Weiterführende elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Eliminierung von Kupfferzellen durch Clodronat Lücken im Endothel hinterlässt, welche den Parasiten vereinfachten Zugang zu Hepatozyten gewähren. Die Verminderung der Kupfferzell-Zahl bei gleichzeitig intakter sinusoidaler Zellbarriere in op/op Mäusen hingegen reduziert die Eintrittsmöglichkeiten für Sporozoiten in das Leberparenchym. Gemeinsam betrachtet belegen diese Daten, dass Kupfferzellen eine Schlüsselrolle bei der Etablierung einer Malariainfektion besitzen. Nach der Invasion eines Hepatozyten entwickeln Sporozoiten sich weiter zu Leberschizonten, sogenannten exo-erythrozytären Formen (EEF), die sich schließlich zu mehreren tausend Merozoiten differenzieren. Jeder dieser Merozoiten ist in der Lage, einen Erythrozyten zu infizieren. Die sich wiederholende synchrone Schizogonie in Blutzellen verursacht dann die typischen Malaria-Symptome. Leberstadien sind deshalb ideale Ansatzpunkte für eine erfolgreiche Medikamenten- und Impfstoffentwicklung, da sie den Übergang zu den pathogenen Blutstadien bilden. Die bisherige Charakterisierung der EEF war beschränkt auf die Analyse von post-mortem Gewebeproben oder in vitro Studien. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit war daher, den Mechanismus der Merozoitenfreisetzung aus den EEF ins Blut in vivo zu bestimmen. Hierzu wurden Mäuse mit fluoreszierenden P. yoelii Sporozoiten (PyGFP) infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie untersucht. Merozoiten wurden nicht, wie ursprünglich vermutet, durch Ruptur der Hepatozyten-Membran einzeln in den Blutstrom entlassen, sondern in Form von Wirtszellmembran-umhüllten Paketen, so genannten Merosomen. Überraschenderweise werden Merosome mit dem Blutstrom intakt aus der Leber heraus und in die Lunge transportiert, wo sie im pulmonalen Kapillarnetz akkumulierten. Die Charakterisierung von isolierten extrahepatischen Merosomen mit diversen Membran-, Apoptose- und DNA-Markern ergab, dass Merosome eine intakte Membran besitzen und vitale Merozoiten enthalten. In einem weiteren Versuch wurde die Infektiosität der merosomalen Merozoiten gezeigt, indem Leber-Blut, dass zusätzlich zu infizierten Erythrozyten Merosomen enthielt, signifikant infektiöser war als Schwanzvenen-Blut mit der gleichen Parasitämie, aber ohne Merosomen. Nachdem die Merosomen sich in der Lunge festgesetzt hatten, erfolgte die Freisetzung der Merozoiten durch Disintegration der sie umschließenden Membran. Dies wird als bisher unbekannter Evasionsmechanismus von Plasmodium interpretiert: Durch Freisetzung der Parasiten im Kapillargebiet der Lunge können Merozoiten der phagozytischen Elimination durch Kupfferzellen in der Leber entgehen, da sie wegen der Umhüllung von Wirtszell-Membran vom Immunsystem des Wirtes nicht erkannt werden können. Außerdem ist es möglich, dass der reduzierte Blutfluss und die geringere Makrophagendichte der Lungenkapillaren von Vorteil für die Invasion von Erythrozyten ist.