Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Comparison of the pathogenesis and immune responses following avian Metapneumovirus subtype A and B infection in broiler-type chickens

Aung, Ye Htut

Avian Metapneumovirus (aMPV) causes TurkeyRhinotracheitis (TRT), an acute respiratory tract infection in turkeys of all ages.  The virus is also associated with swollen head syndrome (SHS) in broilers and broiler breeders.  Four different subtypes (A –D) of aMPV have been differentiated by nucleotide sequence analysis on the basis of the attachment (G) protein.  The pathogenesis of different subtypes of aMPV had been investigated in turkeys intensively.  SHS associated with avian Metapneumovirus (aMPV) subtype A or B in broilers and broiler breeders has been reported worldwide.  However, data about the pathogenesis of aMPV subtype A and B in broilers are scarce and it is still unknown whether there are any differences in pathogenicity of aMPV A and B in broilers.  Since aMPV causes swelling of periorbital sinuses in chickens, aMPV may also affect paraocular glands in this species.  Most of the studies on immune mechanisms against aMPV have been conducted in turkeys but not in broilers.  Therefore, two experiments were carried out to compare the pathogenesis of aMPV subtype A and B of turkey origin in broilers and to investigate selected parameters of the immune response of broilers to aMPVs. Sixteen-day-old and 14-day-old commercial Ross-type broilers free of aMPV maternal antibodies were used in the first and second experiment, respectively.  Two groups of broilers were inoculated oculonasally with 104 median ciliostatic dose (CD50) of turkey isolates of aMPV subtype A or aMPV subtype B.  The third group received virus free trachea organ culture (TOC) supernatant. Clinical signs such as depression, coughing, clear nasal exudates and frothy eyes appeared at 4 days post inoculation (dpi), followed by swelling of infraorbital sinuses at 5 dpi.  Relatively higher numbers of broilers showed clinical signs in subtype B inoculated groups than in subtype A inoculated groups.  Cumulative clinical score indices of subtype B-inoculated groups were significantly higher (P<0.05) than of subtype A-inoculated groups.  At 15 and 17 dpi, subtype A and B-infected broilers had recovered from respiratory signs, respectively.  Virus free TOC media inoculated groups were free of clinical signs in both experiments. Histopathological lesions such as thickening and destructions of the ciliated epithelium of infraorbital sinuses, nasal turbinate, and trachea due to infiltration of lymphoid cells, heterophils and formation of lymphoid follicles were observed between 3 and 11 dpi in aMPV-inoculated broilers.  Histopathological lesion scores of nasal turbinate and trachea were not significantly different between subtype A and B inoculated broilers.  Formation of lymphoid follicles in the submucosa of primary and secondary bronchi of the lung and in the interstitial tissues of paraocular glands was also detected in the virus infected broilers at 6 to 11 dpi.  No histopathological changes were detected in spleen and bursa cloacalis. The distribution of the aMPV genome in different tissues was investigated by RT-nested PCR.  The subtype B genome showed a considerably wider tissue-distribution and longer persistence than the subtype A genome.  In addition to the respiratory tract tissues, the subtype B genome was also detected in the spleen, caecal tonsils, bursa cloacalis and cloacal swabs. In both experiments, aMPV specific serum VN-antibody titres increased significantly (P<0.05) at 6 dpi and reached peak levels at 10 to 11 dpi in both subtypes-inoculated groups.  Serum aMPV-ELISA antibodies were detected at 10 to 11-dpi in aMPV-inoculated broilers and continued to increase until the end of experiment.  The appearance of detectable ELISA aMPV-antibodies coincided with the clearance of the aMPV genome from different tissues after infection.  Both subtypes stimulated not only a systemic humoral responses but also mucosal antibodies in the respiratory tract and bile.  In contrast to the development of serum-ELISA-antibodies, the VN-antibody titres in tracheal washes declined when the aMPV genome was cleared from the upper respiratory tract. The infiltration of CD4+ and CD8+ T cells in the Harderian gland was observed at 6 dpi.  These cells may also be involved in the local antiviral response to aMPV infection in broilers. Overall, this is the first study, which reproduced clinical disease with swelling of infraorbital sinuses in commercial broilers by experimental infection with aMPV subtype A and B of turkey origin.  Both aMPVs affected all ciliated columnar epithelium of the respiratory tract tissues in broilers.  Strong lymphoid cell infiltrations were detected in all respiratory mucosae following infection with both subtypes.  These cells may participate in local immune responses.  Infiltration of inflammatory cells was not only observed in the ciliated epithelium of the respiratory tract but also in paraocular glands, such as Harderian glands and lachrymal glands.  Our study clearly suggests the role of aMPV as a primary pathogen of the respiratory tract for commercial broilers.

Das aviäre Metapneumovirus (aMPV) verursacht die Rhinotracheitis der Pute. Diese akute Infektionskrankheit der oberen Respirationsorgane ist in kommerziell gehaltenen Puten aller Altersklassen von großer Bedeutung. Gegenwärtig sind vier Subtypen (A – D) des aMPV beschrieben. Die Pathogenese dieser aMPV-Subtypen ist bei Puten gut untersucht. Das aMPV steht aber ebenfalls in Zusammenhang mit den „swollen head syndrom“ (SHS) in Hühner der Mastlinie (Broiler). Die aMPV-Pathogenese ist bei Broilern nur unzureichend untersucht. Es gibt keine Erkenntnisse bezüglich eines Unterschiedes in der Pathogenität und Immunantwort zwischen der Infektion mit dem Subtyp A und B des aMPV in Broilern. Ziel dieser Studie war es daher, die Pathogenese und die Induktion von Immunreaktionen einer experimentellen aMPV-Infektion der Subtypen A und B in Broilern miteinander zu vergleichen. Dazu wurden zwei Infektionsversuche durchgeführt. In dem 1. Infektionsversuch wurden 3 Gruppen 16-Tage alter Broiler (Mastlinie Ross) eingesetzt. Alle Broiler waren frei von maternalen Antikörpern gegen das aMPV. Gruppe 1 wurde mit 104 einer mittleren „cilostatischen Dosis“ (CD50) eines aMPV-Putenisolates vom Subtyp A  oculonasal infiziert. Die 2. Gruppe wurde mit derselben CD50 eines aMPV-Putenisolates vom Subtyp B oculonasal infiziert. Die 3.  Gruppe wurde als Kontrollgruppe geführt und mit dem Überstand einer virusfreien Trachealringkultur oculonasal inokuliert. Der 2.  Infektionsversuch wurde mit 14-Tage alten Broilern (Mastlinie Ross) auf die gleiche Weise durchgeführt. In beiden Infektionsversuchen konnten 4 Tage post infectionem (p.i.) klinische Symptome, wie allgemeine Apathie, Husten, Nasenausfluss und Augenausfluss festgestellt werden. 5 Tage p.i. trat eine Schwellung der Infraorbitalsinus auf. In beiden Infektionsversuchen zeigte sich, dass aMPV Subtyp B bei einer größeren Anzahl von Broilern zu klinischen Symptomen führte. Die quantitative Bewertung der klinischen Symptome (cumulative clinical score) der mit aMPV Subtyp B infizierten Broiler war signifikant höher (p<0,05) als die der mit aMPV Subtyp A infizierten Gruppe. Die klinischen Symptome konnten bis 15 Tage p.i. (aMPV Subtyp A) bzw. 17 Tage p.i. (aMPV Subtyp B) beobachtet werden. Die Kontrollgruppen waren bis Versuchsende ohne klinische Symptomatik. Histopathologisch konnte bei den Infektionsgruppen eine Hyperplasie der Mukosa mit einhergehendem Verlust des Zilienepithels im Infraorbitalsinus, den Turbularien der Nasenhöhle und Trachea festgestellt werden. Zwischen dem 3. und dem 11. Tag p.i. kam es bei den Broilern der Infektionsgruppe zu einer Einwanderung von lymphoiden Zellen, heterophilen Granulozyten und der Bildung von lymphoretikulärem Reaktionszentren in den Schleimhäuten des oberen Respirationstrakt. Bezüglich der histopathologischen Veränderungen war kein Unterschied zwischen den mit aMPV Subtyp A und den mit aMPV Subtyp B infizierten Broilern festzustellen. Zwischen dem 6. und dem 11. Tag p.i  kam es zur  Bildung von lymphoretikulärem Reaktionszentren in der Submucosa der primären und sekundären Bronchien der Lungen und in dem Interstitium der paraokulären Drüsen.  Die Milz und die Bursa cloacalis wiesen keine histopathologischen Veränderungen auf. Die Verteilung von aMPV wurde in den verschiedenen Organen mittels einer RT-nested-PCR untersucht. Das aMPV Subtyp B zeigte eine weitere Verbreitung und länger Persistenz in den Organen als das aMPV Subtyp A. Das aMPV Subtyp B konnte außer in den Organen des oberen Respirationstraktes noch in der Milz, den Zaekaltonsillen, der Bursa cloacalis und in Kloaken-Tupfern nachgewiesen werden. Während der Infektionsversuche kam es bei beiden Infektionsgruppen zu einem signifikanten Anstieg der virusneutralisierenden Antikörper (VN-AK) gegen aMPV ab dem Tag 6.pi., welche ihren höchsten Titer am Tag 11.p.i. erreichten. Im ELISA-Test konnten spezifische Serumantikörper gegen das aMPV ab dem 10. Tag p.i. und dem 11. Tag p.i. bis zum Ende der Experimente nachgewiesen werden. Der Anstieg von Serumantikörpern im ELISA korrelierte mit dem Rückgang des Nachweises von aMPV mittels der RT-PCR in den untersuchten Organsystemen.  Im Gegensatz dazu kam es mit der Elimination von aMPV aus dem unteren Respirationstrakt zu einem Abfall der VN-AK in den Tracheal-Spülproben. Beide Subtypen von aMPV induzierten neben der systemischen humoralen Immunität auch eine lokale Immunreaktion im Respirationstrakt und der Gallenblase. Ab dem 6. Tag p.i. konnte eine Infiltration von CD4 und CD8-T-Lymphozyten und damit die Bildung von lymphoretikulärem Reaktionszentren in der Harderschen Drüse und in der Submukosa der oberen Respirationsorgane bei allen Infektionsversuchen nachgewiesen werden. Diese zelluläre Immunantwort ist für die lokale antivirale Immunität der aMPV-Infektion in Broilern möglicherweise von Bedeutung. Die Untersuchungen belegen, dass aMPV als primär pathogener Erreger bei Broilern von Bedeutung ist.

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Aung, Ye Htut: Comparison of the pathogenesis and immune responses following avian Metapneumovirus subtype A and B infection in broiler-type chickens. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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