Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung von schwangerschaftsassoziierten Glykoproteinen der frühen und peripartalen Phase der Trächtigkeit des Rindes

Jeanrond, Evelyne

The present study aims at characterizing bovine PAG-forms of the early and peripartal pregnancy, while focussing particularly on the comparison of their glycosylation. Placentas collected in abbatoirs and during cesarian sections were submitted to biochemical and histochemical analyses, so as to reveal molecular mass, isoforms and structural features of the PAGs and their glycans through ion-exchange-chromatography, electrophoresis and Western blotting with lectins and antiserum against boPAGs. For histochemical analyses in light and double-immunofluorescent techniques, lectins and antibodies against boPAG and the Sda-epitope (CT1-antibody) were used to reveal specific sugars and to evidence colocalization to PAG-positive structures in the BNC of the trophoblast. The trophoblastic material of early pregnancy from day 35 to day 50 of gestation showed a major band at about 67 kDa and several secondary bands in Western blot with anti-boPAG. Material of term-placenta showed a quite small amount of PAG-positive proteins in only three of 60 chromatographically separated fractions and revealed a major band at 66 kDa in Western blot. Molecular weight of PAGs of the early placenta as well as of term placenta was considerably reduced by enzymatic cleavage of N-glycosidic linked sugars, so that high amounts of N-glycans can be presumed in both PAG forms. 2D-electrophoresis and anti-boPAG Western blot was performed with trophoblastic proteins from day 43 and day 50 placenta. While day 43 material showed three isoforms of a 70 kDa protein at pH 4,3 to 5,3 and a single spot of a 66 kDa protein, day 50 material showed three isoforms of both 74 kDa and 66 kDa PAG-positive proteins all in a range from pH 4,7 to 5,2. Lectin-Western blot of term-placenta material showed no DBA-binding in contrast to a broader range of PHA-binding at 67-85 kDa and a more restricted MAL-binding at 72 kDa. These results indicate that near-term expressed glycoproteins carry no terminal GalNAc (DBA) on their glycans, but seem to contain N-acetyl-lactosamin (PHA) with a2,3-linked sialic acid (MAL). In accordance to this, enzymatically desialiated proteins of identical samples showed no more MAL-binding. ECA was binding exclusively to the desialiated protein, revealing the underlying Galß1,4-GlcNAc. Lectin- and immunhistochemistry with the lectins DBA, MAL and PHA and antibodies against boPAG and the Sda-epitope (CT1) demonstrated that bovine PAGs expressed in the BNC carry the Sda-epitope as part of their glycans over a long period of pregnancy. From day 30 to day 275, strong PAG-colocalized binding of the CT1-antibody as well as of the lectin DBA in BNC granules could be observed. Up to day 23, neither CT1 nor DBA did bind to these structures whereas MAL bound in colocalization with the PAG-antibody to the BNC. Similar to this, CT1- and DBA-binding decreased rapidly from day 275 on, while MAL started binding again, increasing with approach to term. The strong PHA-binding did not change during the whole time of pregnancy, showing that the alterations within the glycans do not affect the N-acetyl-lactosamin part of the Sda-epitope. As shown by the DBA and MAL binding patterns, the major change before day 30 and prior to delivery consists in the loss of terminal GalNAc.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von PAG-Formen des Rindes in verschie-denen Phasen der Trächtigkeit mit besonderer Betrachtung des periimplantativen und peripartalen Zeitraumes. Schwerpunkt der Untersuchungen sollte der Vergleich der unterschiedlichen Glykosylierung der Proteine sein. An Plazentamaterial früher, mittlerer und peripartaler Trächtigkeitsstadien wurden biochemische und histochemische Untersuchungen zur Charakterisierung der PAGs und ihrer Glykane durchgeführt. Dabei kamen chromatographische und elektrophoretische Trennungsmethoden, Western Blot-Technik mit Anti-boPAG Serum, sowie mit Lektinen zum Nachweis spezifischer Zuckerstrukturen zur Anwendung. Die histochemischen Untersuchungen erfolgten an Paraffin- und Epon-eingebetteten Schnitten von Plazentamaterial der unterschiedlichen Trächtigkeitsphasen, an denen mit verschiedenen Lektinen spezifische Zuckerstrukturen in den zytoplasmatischen Granula binukleärer Zellen des Trophoblasten nachgewiesen wurden. Desweiteren wurden immunhistochemische Färbungen mit den Antikörpern CT1 gegen das Sda-Epitop und Anti-boPAG-Serum vorgenommen, um zum einen die komplexe Zuckerstruktur im Glykan, zum anderen die Kolokalisation mit den PAG-reaktiven Proteinen nachzuweisen. In Trophoblastgewebe von vier Kühen zwischen Tag 35 und Tag 50 der Trächtigkeit wurde im Western Blot mit Anti-boPAG-Antiserum in allen Proben eine PAG-positive Bande bei ca. 67 kDa in SDS-PAGE nachgewiesen. Das Material der Geburtsplazenta zeigte nach chromatographischer Auftrennung und Western Blotting einen relativ geringen Anteil an PAG-immunnoreaktiven Proteinen in drei von 60 Eluatfraktionen. Die darstellbaren Banden lagen wie für die frühen Stadien hauptsächlich bei 66 kDa mit Nebenbanden im Bereich niedrigerer molekularer Masse. Durch enzymatische Abspaltung N-glykosidisch gebundener Zucker mit Peptid-Glykosidase F ließ sich das Molekulargewicht der PAG-reaktiven Proteine sowohl der frühen als auch der geburtsnahen Plazenta erheblich verringern, so dass auf einen hohen Anteil an N-Glykanen in PAGs geschlossen werden kann. Die zweidimensionale Auftrennung der frühen Trophoblastproteine nach isoelektrischem Punkt und Molekulargewicht zeigte unterschiedliche Isoformen PAG-reaktiver Proteine für Tag 43 und Tag 50 der Trächtigkeit. Zu Tag 43 konnten drei Isoformen eines 70 kDa Proteins zwischen pH 4,5 und 5,3 nachgewiesen werden. Zu Tag 50 wurden drei Isoformen eines 66 kDa-Proteins zwischen pH 4,7 und 4,9, sowie drei Isoformen eines 74 kDa-Proteins zwischen pH 4,8 und 5,2 gefunden. Ein Lektin-Western Blot an PAG-angereichertem Plazentamaterial der Geburt mit den Lektinen Dolichos biflorus Agglutinin (DBA), Phaseolus vulgaris Agglutinin (PHA) und Maackia amurensis Leukoagglutinin (MAL) zeigte keinerlei DBA-Bindung, diffuse PHA-Bindung im Molekularbereich von 67-85 kDa und MAL-Bindung im Bereich von ca. 72 kDa. An Glykoproteinen der geburtsreifen Plazenta ließ sich demnach kein terminales GalNAc (DBA), wohl aber N-Acetyl-Laktosamin (PHA) mit α2,3-gebundener Neuraminsäure (MAL) als Strukturelemente nachweisen. Im Lektin-Western Blot mit MAL und Erithrina cristagalli Agglutinin (ECA) konnte vor enzymatischer Abspaltung der Neuraminsäure durch die ausschließliche Bindung von MAL α2,3-sialyliertes Galaktosyl-(ß1,4)-GlcNAc nachgewiesen werden. An den desialylisierten Proben konnte hingegen nur das ECA an das darunterliegende Galaktosyl- (ß1,4)-GlcNAc binden. Die Glykane der PAG-reaktiven Proteine aus der geburtsreifen Plazenta sind demnach zum einen N-glykosidisch gebunden und tragen α2,3-sialyliertes Galaktosyl-(ß1-4)-GlcNAc als Teil ihrer Struktur.Durch die lektinhistochemischen Untersuchungen mit den Lektinen DBA, MAL und PHA, sowie mit den Antikörpern CT1 und Anti-boPAG konnte gezeigt werden, dass über eine lange Zeitspanne der Trächtigkeit, nämlich zwischen Tag 32 und Tag 275, das Sda-Epitop als Bestandteil der PAG-Glykane ausgebildet wird. In diesem Zeitraum war in allen Schnitten eine deutliche Kolokalisation des an das Sda ‑Glykotop bindenden Antikörpers CT1, sowie der Lektine, DBA und PHA mit Anti-boPAG-Serum zu beobachten. Die Alterationen in der Glykosylierung vor und nach dieser Phase konnten durch verändertes Bindungsverhalten des CT1-Antikörpers und der Lektine DBA und MAL dargestellt werden. Bis Tag 32 waren kein terminales GalNAc, und keine entsprechend vollständige Sda-Epitop-Struktur mit DBA bzw. CT1 nachzuweisen. Die Bindung von MAL an die BNC-Granula in Kolokalisation mit dem Anti-boPAG zu diesem Zeitpunkt bestätigte jedoch α2,3-sialyliertes Galaktosyl-(ß1-4) N-Acetyl-glukosamin als Teil des Sda-Epitops ohne terminales GalNAc. Das gleiche Bindungsverhalten der genannten Antikörper und Lektine kurz vor der Geburt deutet auch hier auf die Reduktion des terminalen GalNAcs in der Glykanstruktur der peripartal exprimierten PAGs hin.

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Jeanrond, Evelyne: Charakterisierung von schwangerschaftsassoziierten Glykoproteinen der frühen und peripartalen Phase der Trächtigkeit des Rindes. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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