Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung eines Pseudovirussystems zur funktionellen Analyse der Hüllglykoproteine des Bovinen Virusdiarrhoe-Virus

Ronecker, Saskia Ines

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) belongs to the genus Pestivirus of the family Flaviviridae. It causes one of the most important viral diseases of cattle worldwide and is notifiable in Germany since 2004. The function of the envelope glycoproteins during viral entry is of utmost importance for understanding the pathogenesis of bovine viral diarrhea/mucosal disease. The envelope of BVDV contains three glycoproteins, namely the Erns, E1, and E2. In infected cells they can be found as monomers as well as disulfide-linked homodimers (Erns, E2) and heterodimers (E1E2). E2 and to a lesser extent Erns induce neutralizing antibodies. Thus, these proteins are considered to be responsible for virus attachment and/or cell entry. In this study the envelope glycoproteins which are essential for virus entry were identified and their functional form determined. A pseudotype system based on Vesicular stomatitis virus (VSV) was developed to allow analyses of the single proteins. A recombinant VSV harbouring the gene for the green fluorescent protein instead of the glycoprotein G gene was used. This recombinant VSV can merely replicate if it is complemented with an envelope protein in trans. Pseudotypes containing native as well as chimeric BVDV glycoproteins were generated and analyzed for their infectivity. In the chimeric proteins the transmembrane domains were replaced by the corresponding region of the VSV G protein. It could be shown that E1 and E2 were sufficient to mediate BVDV entry while Erns was dispensable. Modification of the BVDV envelope glycoproteins resulted in a loss of functionality. To further characterize this phenomenon the chimeric proteins were analyzed with regard to E1E2 heterodimer formation. There was no heterodimer formation if one of the proteins was chimeric, indicating that the heterodimers are the functional form for viral entry. To identify the amino acids involved in this process, plasmids, expressing modified proteins, were generated by point mutations in the transmembrane domains. The cysteine at position 668 had no influence on the interaction of E1 with E2. Substitution of the charged amino acid residues at positions 671 (lysine) and 674 (arginine) as well as 1047 (arginine) prevented heterodimer formation in different degrees. This demonstrates for the first time that beside disulfide bonds the charged amino acids within the transmembrane domains of E1 and E2 are essential for heterodimer formation.

Das Bovine Virusdiarrhoe-Virus (BVDV) gehört zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae. Es verursacht eine der wirtschaftlich bedeutendsten Infektionserkrankungen des Rindes weltweit, die seit 2004 in Deutschland der Anzeigepflicht unterliegt. Die Rolle der am Viruseintritt beteiligten Hüllglykoproteine ist für das Verständnis der Pathogenese von herausragender Bedeutung. Die Hülle des BVDV enthält die Glykoproteine Erns, E1 und E2. In infizierten Zellen können diese sowohl als Monomere als auch als Homodimere (Erns, E2) und Heterodimere (E1 E2) nachgewiesen werden. Letztere werden durch Disulfidbrücken stabilisiert. Die Induktion neutralisierender Antikörper durch das Hüllglykoprotein E2 und in geringerem Ausmaß auch durch Erns spricht für eine Funktion bei der initialen Anlagerung des Virus an die Zelle. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Hüllglykoproteine des BVDV für den Eintritt in die Zelle essentiell sind und deren funktionelle Form näher charakterisiert. Um die Proteine und deren Funktion unabhängig voneinander analysieren zu können, wurde ein Pseudovirussystem auf der Grundlage des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) erstellt. Das hierzu verwendete rekombinante VSV enthielt statt des Gens für das Hüllglykoprotein G, das Gen für das enhanced green fluorescent protein (EGFP) und war somit replikationsdefekt, solange ihm nicht ein Hüllprotein in trans zur Verfügung gestellt wurde. Pseudoviren wurden sowohl mit den nativen BVDV Hüllglykoproteinen als auch mit chimären Proteinen erstellt, deren potentielle Transmembranregionen gegen die des VSV G Proteins ersetzt wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die Glykoproteine E1 und E2 ausreichen, um den Viruseintritt in die Zelle zu vermitteln, während Erns entbehrlich ist. Gleichzeitig wurde deutlich, dass mit Modifikation der Hüllglykoproteine ein Verlust ihrer Funktionalität einhergeht. Da die chimären Proteine nicht in der Lage waren Heterodimere auszubilden, kann der Schluss gezogen werden, dass E1 E2 Heterodimere die funktionelle Form für den Viruseintritt darstellen. Die für die Heterodimerbildung essentiellen Aminosäuren wurden mit Hilfe modifizierter Proteine identifiziert. Die dafür kodierenden Plasmide wiesen Punktmutationen in den für die Transmembranregionen der Proteine kodierenden Genabschnitten auf. Das Cystein an der Position 668 hatte keinen Einfluss auf die Dimerisierung. Hingegen beeinflusste die Substitution der geladenen Aminosäuren an den Positionen 671 (Lysin) und 674 (Arginin) sowie 1047 (Arginin) die Heterodimerbildung in unterschiedlichem Ausmaß. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass für die erfolgreiche Heterodimerisierung nicht nur die Disulfidbrücken eine Rolle spielen, sondern auch geladene Aminosäuren innerhalb der Transmembranregionen der Glykoproteine E1 und E2. 

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Ronecker, Saskia Ines: Etablierung eines Pseudovirussystems zur funktionellen Analyse der Hüllglykoproteine des Bovinen Virusdiarrhoe-Virus. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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