Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular genetic analysis of primary cataracts in the Dachshund and the Entlebucher mountain dog

Müller, Christina

The objectives of this study were to identify the genetic background of primary cataracts (CAT) in the Dachshund (DH) and the Entlebucher mountain dog (EMD) and additionally, for the DH the evaluation of risk factors for CAT and the estimation of genetic parameters for CAT and two other types of lens opacifications, which were also quite frequent in the investigated population, but are considered as not inherited by ophthalmologists. The statistical analysis of the influence of systematic environmental effects on the prevalences of CAT, fibreglass cataract in the nucleus (FCN), and prominent suture lines (PSL) and the estimation of the heritabilities of these three traits in the wild-boar-colored wirehaired DHs (WWD) bred in the German Dachshund Club 1888 e.V. (DTK) was performed first. This analysis included 2,430 WWD born between 1995 and 2003 that were examined between 1996 and 2005 by veterinary ophthalmologists. Sex, size, inbreeding coefficient, the experience of the veterinary ophthalmologist and the age at examination were tested for significance in multiple analyses of variance for the three traits. Genetic parameters for CAT, FCN and PSL were estimated using residual maximum likelihood (REML)in a linear multivariate animal model. The heritability estimates and residual correlations of the linear animal model analyses were transformed into the threshold model according to Dempster and Lerner (1950). We found high positive genetic correlations (rg) between CAT and PSL (rg = 0.79 ± 0.06) and between PSL and FCN (rg = 0.83 ± 0.23). Also a positive correlation was found between CAT and FCN (rg = 0.58 ± 0.21). The heritability estimates (hDL2) for WWD were hDL2 = 0.39 ± 0.13 for CAT, hDL2= 0.36 ± 0.11 for FCN and hDL2= 0.49 ± 0.12 for PSL. For molecular genetic investigations of CAT in the EMD and the DH, we first searched the literature for genes which are known to be involved in the pathogenesis of CAT in humans or mice. We found 31 genes, which had to be considered as candidates for primary cataracts.We chose two different methods for the investigation of these genes in both breeds. For some genes, we carried out a mutation analysis, for other genes, we used flanking microsatellites to test them for linkage and association with CAT. For both breeds we could exclude the only known CAT causing mutation in the dog to date, an insertion in exon 9 of the canine HSF4 gene in Staffordshire bull terriers and Boston terriers. By sequencing exon 9 in affected and unaffected DHs and EMDs, we could not find this mutation in any of the investigated dogs. In the DH, nearly all of the candidate genes investigated showed no significant linkage or association with the CAT phenotype and therefore could be excluded to be involved in the pathogenesis of CAT in this breed. Only for the single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the CRYAA, CRYGA and CRYGD genes we could detect significant linkage with CAT. These SNPs were found by means of a mutation analysis of these genes. We sequenced the whole coding sequence of the three genes, which are localized on canine chromosome (CFA) 31 (CRYAA) and CFA37 (CRYGA, CRYGD). For none of the linked SNPs a significant association was present. For CFA31, we additionally genotyped five microsatellites markers, which covered this chromosome evenly to assure that the CAT-causing mutation is not hidden elsewhere. As this scan of CFA31 did not reveal significant results for linkage or association with the CAT phenotype in our DH family, we not only the exclude the canine CRYAA gene, but also the other parts of CFA31 for harboring the causal mutation for CAT. Also on CFA37 further markers have to be genotyped to find to finally exclude these genes. In the EMD, we could exclude all investigated known CAT candidate genes for harboring the CAT-causing mutation, but we could identify a CAT linked region on CFA1 using candidate gene flanking microsatellites. We excluded the two candidate genes on CFA1, which flanking markers had shown significant linkage, by sequencing the coding sequence of both genes in affected and unaffected EMDs. None of the SNPs identified reached significant linkage or association with the CAT phenotype. The following genotyping of eight additional microsatellite markers on CFA1 increased and shifted the linked region proximal of our candidate genes on CFA1, but by haplotype analyses of several EMDs of different families, the linked region could be delimited to about 28.0 Mb. Further research is necessary to delimit this linked genomic region and to determine the gene responsible for CAT, because the known candidate genes localized in this genome section could be excluded and no other possible candidate genes are known in this region to date. Finally, we can conclude that the candidate genes for CAT in humans and mice known to date are not sufficient to clarify the molecular genetic background of CAT in the two dog breeds investigated here. The indications for other possible CAT-linked genome regions which were provided by our investigations should be approved by further molecular genetic analyses. These analyses could consist in a whole genome scan using microsatellite markers or an SNP microarray. The collection of blood samples in the course of the official ophthalmological examinations is recommended to assure that enough informative samples are available for these further investigations.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die molekulargenetische Untersuchung der primären Katarakt (KAT) beim Dackel (DH) und beim Entlebucher Sennenhund (ESH). Des Weiteren sollten die Risikofaktoren für die Prävalenz der KAT beim Dackel untersucht, sowie die genetischen Parameter für KAT und zwei andere Formen der Linsentrübung, die in der untersuchten Dackelpopulation auftraten und bisher als nicht erblich eingestuft werden, geschätzt werden. Zunächst wurde die Bedeutung von systematischen Effekten auf das Auftreten von KAT, Glaswollstar (GW) und Nahtstar (NS) der im Deutschen Teckelklub 1888 e.V. (DTK) gezüchteten saufarbenen Rauhaardackel (SRD) statistisch analysiert; anschließend wurden die genetischen Parameter für diese Augenbefunde in einem multivariaten Tiermodell geschätzt. Die Datengrundlage für diese Analyse bildeten die Ergebnisse der Untersuchungen auf erbliche Augenerkrankungen, die von Tierärzten des DOK sowie von Fachtierärzten für Ophthalmologie zwischen 1996 und 2005 bei 2430 zwischen 1995 und 2003 geborenen SRD durchgeführt wurden. In der Varianzanalyse wurden die fixen Effekte des Geschlechts, der Größenklasse, der Inzuchtkoeffzientenklasse sowie der Tierarztklasse und das Alter des Tieres zum Zeitpunkt der Diagnose der jeweils betrachteten Augenerkrankung bzw. der letzten Untersuchung auf Signifikanz für KAT, GW und NS getestet. Die genetischen Parameter wurden mittels der Residual Maximum Likelihood- (REML) Methode in einem multivariaten linearen Tiermodell geschätzt. Die linear geschätzten Heritabilitäten und residualen Korrelationen wurden nach Dempster und Lerner (1950) ins Schwellenmodell transformiert. Wir fanden hohe positive genetische Korrelationen (rg) zwischen KAT und NS (rg = 0,79 ± 0,06) und zwischen NS und GW (rg = 0,83 ± 0,23); auch zwischen KAT und GW (rg = 0.58 ± 0.21) bestand eine positive genetische Korrelation. Es wurden Heritabilitäten (hDL2) von hDL2 = 0,39 ± 0,13 für KAT, hDL2 = 0,36 ± 0,11 für GW und hDL2 = 0,49 ± 0,12 für NS in der untersuchten SRD-Population geschätzt. Für die molekulargenetische Untersuchung der KAT beim DH und beim ESH durchsuchten wir zunächst die Literatur nach Genen, von denen ein Zusammenhang mit der Entwicklung von KAT bei Mensch und/oder Maus bereits bekannt war. Wir fanden 31 Gene, die als potentielle Kandidatengene für KAT auch beim Hund in Frage kamen. Diese Gene wurden in beiden Rassen mittels zweier unterschiedlicher Vorgehensweisen untersucht. Für einige der Gene führten wir eine Mutationsanalyse durch, andere Gene wurden mittels flankierender Mikrosatelliten auf Kopplung und Assoziation mit dem Merkmal KAT getestet. Für beide Rassen konnten wir ausschließen, dass die von Mellersh et al. (2006) beim Staffordshire Bull Terrier und beim Boston Terrier entdeckte Mutation für den KAT-Phänotyp verantwortlich ist, da diese Insertion in Exon 9 weder in KAT-betroffenen noch KAT-freien DHs und ESHs gefunden werden konnte. Beim Dackel konnte auch in keinem der weiteren untersuchten Gene eine als Ursache für KAT in Frage kommende Mutation identifiziert werden, jedoch wiesen die in drei verschiedenen Kristallin-Genen (CRYAA, CRYGA und CRYGD) mittels Mutationsanalyse gefundenen Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) eine signifikante Kopplung auf. Allerdings konnte für keinen dieser SNPs auch eine signifikante Assoziation festgestellt werden. Von allen drei Genen, die sich auf den caninen Chromosomen (CFA) 31 (CRYAA) und 37 (CRYGA, CRYGD) befinden, wurde die gesamte kodierende Sequenz untersucht. Auf CFA31 genotypisierten wir fünf zusätzliche Mikrosatelliten, die das Chromosom gleichmäßig abdeckten, um sicher zu gehen, dass die KAT-verursachende Mutation nicht an anderer Stelle auf diesem Chromosom lokalisiert ist. Da für diese Marker keine signifikante Kopplung oder Assoziation gefunden wurde, schließen wir neben dem caninen CRYAA-Gen auch CFA 31 als Träger der kausalen Mutation für KAT beim Dackel aus. Für CFA37 sollten ebenfalls zusätzliche Marker typisiert werden, um das CRYGA- und das CRYGD-Gen ebenfalls endgültig ausschließen zu können. Beim ESH konnten wir alle untersuchten, bekannten Kandidatengene als ursächlich für KAT ausschließen, fanden jedoch mit Hilfe Kandidatengen-flankierender Mikrosatelliten einen signifikant gekoppelten Bereich auf CFA1. Die bei der Mutationsanalyse der in diesem Bereich liegenden beiden Kandidatengene gefundenen SNPs zeigten weder signifikante Kopplung noch Assoziation, weswegen diese beiden Gene von uns ausgeschlossen werden konnten. Die anschließende Typisierung acht weiterer Mikrosatelliten auf CFA1 vergrößerte und erweiterte den gekoppelten Bereich nach proximal; durch Haplotypenanalyse konnte dieser gekoppelte Bereich aber auf etwa 28 Mb begrenzt werden. Zum jetzigen Zeitpunkt sind in dem gekoppelten Bereich auf CFA1 keine weiteren Kandidatengene für KAT bekannt, und auch die Suche nach funktionellen Kandidatengenen innerhalb der gekoppelten Region verlief bisher erfolglos. Daher ist weitere Forschung notwendig, um den gekoppelten Bereich weiter einzugrenzen, andere mögliche Kandidatengene zu identifizieren und diese beim ESH zu untersuchen. Es ist abschließend festzustellen, dass die bisher bei Mensch und Maus bekannten KAT-Kandidatengene nicht ausreichen, um die KAT auch in den beiden untersuchten Hunderassen aufzuklären. Den durch diese Arbeit erhaltenen Hinweisen auf mögliche weitere, bisher unbekannte, mit KAT in Zusammenhang stehende Genomregionen bzw. Gene sollte daher in weiteren molekulargenetischen Untersuchungen nachgegangen werden. Diese weiterführenden Untersuchungen könnten in einem Genomscan mit Mikrosatellitenmarkern oder einem SNP-Microarray bestehen. Um ausreichend adäquates Untersuchungsmaterial für diese Untersuchungen zur Verfügung zu haben ist es empfehlenswert, Blutproben im Rahmen der offiziellen ophthalmologischen Untersuchungen zu entnehmen.

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Müller, Christina: Molecular genetic analysis of primary cataracts in the Dachshund and the Entlebucher mountain dog. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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