Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Mikrobiologische Umgebungsuntersuchung bei der Herstellung von Säuglingsnahrung unter Berücksichtigung von Hygieneparametern, Enteobacter sakazakii, Listeria monocytogenes und Salmonellen

Wernsmann, Ruth Angela

The production of infant food is subject to legal regulations. One such regulation is regulation (EC) No. 2073/2005 implementing the enforcement of regulations within food producing companies as well as defining the microbiological criteria for certain micro-organisms. Further regulations as to the production of infant food are laid down in the basic regulation No. 178/2002 with the corresponding EU hygienic packet regulations (EC) as well as regulations for diet (food/nutrition). All legal requirements that will be taken into consideration in this paper contribute to minimizing the risk of contamination with undesired human pathogenic germs during the processing of infant food. Food producing companies manufacturing products requiring a high standard of safety and quality are therefore asked to carry out strict controls during the processing of production. In order to receive information about the hygienic status of production areas, samples should be taken in specific locations. The aim of this study is to determine useful spots for sampling to perform a hygiene monitoring in the production environment. Additionally, two different PCR-systems were tested for their efficiency. The pathogenic micro-organisms that play a role in the production of infant food and are analyzed in this study are E. sakazakii,  L. monocytogenes and Salmonella. The hygiene parameters yeast, mould, and Enterobacteriaceae were also tested. The tests were conducted over a period of six months. Samples were taken at 35 defined locations once a week. The material consisted of seven drain samples, seven swab samples, and 21 powder samples. The selective enrichment chosen specifically for the micro-organisms L. monocytogenes, E. sakazakii, and Salmonella required an incubation period of 24 hours. Hence, all samples could be examined within the same rhythm of testing with the help of the different PCR-systems. The BAX® PCR-system with the corresponding test kits was available for the analysis of Salmonella, E. sakazakii and L. monocytogenes. Parallel to this analysis, the same samples were analyzed for Salmonella and L. monocytogenes with the real-time PCR®-equipment 7500 and corresponding test kits. The two PCR-systems facilitated analysis of the different micro-organisms at the same time on a single test rack.  Furthermore, the powder samples were microbiologically tested for yeast, mould, and Enterobakteriaceae. Finally, all the samples with a positive PCR result were again confirmed culturally and biochemically. The cultural analysis of the single germs took place according to analytic methods of reference. For the biochemical confirmation for E. sakazakii the commercially available RapID one® test was used.  For the confirmation of Salmonella it was api® 20E and for L. monocytogenes api® Listeria was used. During the 6 month period of testing, 867 samples were taken and analyzed for the existence of E. sakazakii, Salmonella and L. monocytogenes. The BAX® PCR-system detected E. sakazakii in 198 samples. These samples were then tested again with the help of the cultural method of reference. During the second analysis the germ was discovered in 35 samples. The different results are due to a not selective enrichment for E. sakazakii. The samples were incubated at 37 °C instead of 44 °C. Furthermore, this enrichment did not contain vancomycin as an inhibitor nor was it modified by NaCl. However, there is a possibility that E. sakazakii could not be cultivated from these samples because the amount of germs was too low at the beginning of the test or that too many of the germs were damaged. Another possibility may be that a microbial flora consisting of other Enterobakteriaceae had suppressed E. sakazakii during the period of incubation. 4% of the samples that had been tested contained E. sakazakii corresponding to the BAX® PCR-system and the method of cultural reference. During spring, an increased amount of E. sakazakii was credited to the seasonal increase in production. 33 of the 35 positive samples were powder samples and two were samples from different drains. The ingredients of the powder samples were powder from overflow, from filters, and from vacuum cleaners. 19 powder samples from vacuum cleaners alone contained E. sakazakii. Particularly critical were the positive samples from filters and from overflow as these samples were taken directly from the production plants and had been in contact with the food products. Additionally, all the work places that tested positively for E. sakazakii were almost always contaminated heavily with yeast, mould and Enterobakteriazeen. Among them were the agglomeration area, the process of settling, canning packaging into collapsible boxes and spray drying (towers C and D). Furthermore, a large amount of yeast, mould, and Enterobakteriazeen were detected in the silo. Although tests for Salmonella and L. monocytogenes were positive by the BAX® PCR, the results could not be confirmed by the real-time PCR® 7500 or the cultural method. The swab samples did not show any positive results during the period of analysis. Therefore, this method of analysis could be discontinued or the samples should be taken from a different location. The agglomeration area had locations for taking samples with powder containing a large amount of starch that swelled up during enrichment. This resulted in samples that were difficult to handle and process with the test kits of PCR and the corresponding steps of working with the pipette. Such a sample matrix hindered the evaluation capabilities of the PCR equipment. It is therefore recommended for future analysis to take additional steps to dilute samples taken from these important locations. Generally, the locations for taking samples were sufficient and well-located. They supplied meaningful results and uncovered areas susceptible to contamination. It will continue to be difficult to elimiate E. sakazakii. Therefore, monitoring the area of processing and the product itself for the existence of Enterobakteriazeen (applying the regulations of GMP/GHP and of HACCP) will continue to contribute to the reduction of E. sakazakii. Pertaining to the contaminated areas of work that have been identified by this study, measures of hygiene will be taken to help minimize the aforementioned micro-organisms. Furthermore, employees must be continually trained to develop a better understanding of hygiene. Plastic tubs for vacuum cleaners need to be cleaned and disinfected at least once a week. Furthermore, in areas of work with a high amount of dust pollution on floors and surfaces, regular vacuum cleaning will be necessary. The appearance of Enterobacteriaceae where infant food is manufactured will be diminished by ensuring that only authorised personnel will be allowed access to the area. Furthermore only the equipment necessary for work may be taken to the work place. Attention shall be paid to drains to ensure water cannot overflow and transport micro-organisms to the places of production. A division of wet and dry areas in the processing area should be priority. It should be noted that E. sakazakii and Salmonella do not survive pasteurization. Nevertheless, uncontaminated infant food can be contaminated again during the packaging process. Careful separation between the stages of production, a strict control of all ingredients, and a certification of raw materials by the supplier might help prevent this risk. The BAX® PCR-system proved to be effective during the period of testing and fulfils the requirements for testing large volumes of samples as they are needed for food processing. The system is easy to handle, needs a short amount of time for analysis, supplies reliable results, and meets the criteria of the European standard and the national standards according to § 64 LFBG. Upon completion of this study, this system was adapted by the microbiological laboratory of the food producing company involved in the study to routinely detect Salmonella, L. monocytogenes, E. sakazakii, and Staphylococcus aureus. A result of the knowledge gained by this analysis was the decision to continue monitoring the production environment by means of taking regular samples at important locations. Additionally, a device that measures airborne contaminants will be used in areas known for having a high level of micro-organisms.

Die Produktion von Säuglingsnahrung unterliegt gesetzlichen Vorgaben. Dazu zählt die Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 mit den Durchführungsbestimmungen für Lebensmittelunternehmen sowie die Festlegung mikrobiologischer Kriterien für bestimmte Mikroorganismen. Weitere Bestimmungen zur Herstellung von Kindernahrung sind in der Basisverordnung 178/2002 mit dem dazugehörigen EU- Hygienepaket, sowie in der Diätverordnung festgelegt. Alle gesetzlichen Vorgaben, die auch in der vorliegenden Arbeit berücksichtigt wurden, tragen dazu bei, das Risiko einer Kontamination mit unerwünschten humanpathogenen Keimen während der Herstellung von Säuglingsnahrung zu minimieren. Lebensmittelbetriebe, die sichere und qualitativ hochwertige Nahrungsmittel produzieren, müssen deshalb strenge Prozesskontrollen durchführen. Vor diesem Hintergrund sollten in einem Lebensmittelbetrieb an festgelegten Probenentnahmestellen Umfeldproben gezogen werden, die Aufschluss über den Hygienezustand der Produktionsräume geben. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, sinnvolle Probenentnahmestellen für ein Hygienemonitoring im Betriebsumfeld festzulegen. Außerdem sollten zwei unterschiedliche PCR- Systeme hinsichtlich ihrer Effizienz getestet werden. Als pathogene Mikroorganismen, die bei der Herstellung von Säuglingsnahrung eine Rolle spielen, wurden hierbei E. sakazakii, L. monocytogenes, Salmonellen, sowie als Hygieneparameter Hefen, Schimmel und Enterobakteriazeen untersucht. Die Untersuchungen erfolgten über einen Zeitraum von sechs Monaten. Es wurden an 35 festgelegten Probenentnahmestellen einmal pro Woche Umfeldproben gezogen. Das Probenmaterial bestand aus sieben Gullyproben, sieben Tupferproben und 21 Pulverproben. Die für die Mikroorganismen jeweilig ausgewählte Selektivanreicherung für L. monocytogenes und E. sakazakii, sowie die Anreicherung für Salmonellen benötigte eine Inkubationszeit von 24 Stunden. Somit konnten alle Proben im selben Untersuchungsrhythmus mit den verschiedenen PCR-Systemen weiter untersucht werden. Zur Verfügung stand das BAX® PCR-System mit den dazugehörigen Test-Kits für die Analyse von Salmonellen, E. sakazakii und L. monocytogenes. Parallel dazu wurden die gleichen Proben mit dem Real-time PCR® Gerät-7500 und den entsprechenden Test-Kits auf das Vorhandensein von  Salmonellen und L. monocytogenes untersucht. Mit beiden PCR-Systemen konnten die verschiedenen Mikroorganismen auf einem Untersuchungsrack gleichzeitig analysiert werden. Die Pulverproben wurden zusätzlich mikrobiologisch auf Hefen, Schimmelpilze und Enterobakteriazeen untersucht. Anschließend wurden alle Proben, die zu einem positiven PCR-Ergebnis geführt hatten, noch einmal kulturell untersucht und biochemisch bestätigt. Die kulturelle Untersuchung der einzelnen Keime erfolgte nach den analytischen Referenzmethoden. Für die biochemische Bestätigung wurde für E. sakazakii der kommerziell erhältliche RapID one® Test eingesetzt und für die Bestätigung von Salmonellen Api® 20E, sowie für L. monocytogenes Api®Listeria. Im Untersuchungszeitraum wurden insgesamt 867 Proben entnommen und auf das Vorkommen von E. sakazakii, Salmonellen und L. monocytogenes untersucht. Das BAX® PCR-System ermittelte in 198 Proben E. sakazakii. Diese Proben wurden im Anschluss noch einmal mit der kulturellen Referenzmethode untersucht. Dabei konnte der Keim in 35 Proben ausfindig gemacht werden. Die unterschiedlichen Untersuchungsergebnisse basieren auf einer nicht so selektiv gewählten Anreicherung für E. sakazakii. Statt 44°C wurden die Proben bei 37°C inkubiert. Außerdem enthielt diese Anreicherung weder Vancomycin als Inhibitor, noch wurde sie mit NaCl modifiziert. Es besteht aber auch die Möglichkeit, dass E. sakazakii aus diesen Proben nicht kultiviert werden konnte. Das kann zum einem daran liegen, dass der Keimgehalt von Anfang an sehr niedrig oder die wenigen Keime bereits zu geschädigt waren, um erneut nachgewiesen werden zu können. Zum anderen kann auch eine Keimflora, bestehend aus anderen Enterobakteriazeen, E. sakazakii während der Inkubation verdrängt haben. Vier Prozent der gesamten untersuchten Umfeldproben enthielten übereinstimmend mit dem BAX® PCR-System und der kulturellen Referenzmethode E. sakazakii. Eine zeitliche Häufung von E. sakazakii im Frühjahr war auf die vermehrte Produktion zurückzuführen. Von den 35 positiven Proben stammen 33 aus Pulverproben und zwei aus verschiedenen Gullys. Die Pulverproben setzten sich aus Überlaufpulver, Filterpulver und Staubsaugerpulver zusammen. Allein 19 untersuchte Staubsaugerpulverproben enthielten E. sakazakii. Besonders kritisch sind aber die positiven Filterproben und die Überlaufpulverproben zu bewerten, weil sie direkt aus den Produktionsanlagen stammen und Kontakt zu den Produkten hatten. In diesem Zusammenhang sind auch die Ergebnisse zum Nachweis von Hefen, Schimmel und Enterobakteriazeen zu betrachten. Alle Arbeitsbereiche, die positive E. sakazakii-Probenentnahmestellen beherbergten, waren in der Regel auch stark mit Hefen, Schimmel und Enterobakteriazeen kontaminiert. Dazu zählten die Agglomeration, die Absackung im Keller, die Dosenabfüllung, die Faltschachtelabfüllung und die Sprühtrocknung der Türme C/D. Außerdem konnte zusätzlich im Bereich der Siloanlage ein starkes Hefen-, Schimmelpilz- und Enterobakteriazeen-Vorkommen registriert werden. Die Untersuchung der Proben auf Salmonellen und L. monocytogenes ergaben zwar einige positive BAX®-Ergebnisse, diese konnten aber nicht mit dem Real- time PCR® 7500 und den kulturellen Methoden übereinstimmend bestätigt werden. Die Tupferproben lieferten während des Untersuchungszeitraumes keine positiven Ergebnisse. Deshalb können sie in Zukunft eingestellt oder durch neue Probenentnahmestellen ausgetauscht werden. Der Arbeitsbereich der Agglomeration besaß Probenentnahmestellen mit stärkehaltigem Pulver, das während der Anreicherung aufquoll. Dadurch waren diese Proben in der weiteren Verarbeitung mit den Test-Kits der PCR und den dazugehörigen Pipettierschritten schwierig zu handhaben. Die Probenmatrix hemmte die Auswertung der PCR-Geräte. Deshalb wäre es für die zukünftige Untersuchung ratsam weitere Verdünnungsschritte für diese wichtigen Probenentnahmestellen einzuleiten. Die Probenentnahmestellen waren insgesamt ausreichend und gut in den Arbeitsbereichen positioniert. Sie lieferten aussagekräftige Ergebnisse und konnten dadurch Schwachstellen aufdecken. Es wird jedoch auch in Zukunft schwierig sein   E. sakazakii zu eliminieren. Daher kann die Überwachung auf Enterobakteriazeen  in der Verarbeitungsumgebung und im Produkt (auf Basis der GMP/GHP- und HACCP-Richtlinien) weiterhin dazu beitragen die Prävalenz von E. sakazakii zu verringern. Für die hier betroffenen kontaminierten Arbeitsbereiche wurden daher hygienerelevante Maßnahmen getroffen, die dazu beitragen, die genannten Mikroorganismen im Umfeld zu minimieren. Die Mitarbeiter werden weiterhin für ein richtiges und umfassendes Hygieneverständnis geschult. Die Staubsaugerplastikwannen werden mindestens einmal pro Woche geleert und desinfiziert. Außerdem werden in den Arbeitsbereichen mit einer hohen Staubbelastung regelmäßig die Fußböden und Oberflächen abgesaugt. Der Eintrag von Enterobakteriazeen soll eingedämmt werden, indem sichergestellt wird, dass sich nur berechtigte Personen im Arbeitsbereich aufhalten. Außerdem darf nur das benötigte Arbeitsmaterial eingeführt werden. Es wird darauf geachtet, dass die Gullyabläufe funktionieren, um ein Übertreten des Abwassers und damit der eventuell vorhandenen Mikroorganismen in den Produktionsbereich zu vermeiden. Eine räumliche Trennung der Nass- und Trockenschritte während der Herstellung und die Vermeidung von Feuchtigkeit in den Trockenbereichen können weitere Verbesserungen bewirken. E. sakazakii und Salmonellen überleben die während der Herstellung verwendeten Pasteurisierungsverfahren nicht. Trotzdem kann es bei der Handhabung und Abfüllung zu einer Rekontamination der Säuglingsnahrung kommen. Dem ist vorzubeugen durch die sorgfältige Trennung der Zwischenprodukte, eine strenge Kontrolle aller Zutaten, sowie eine von den Vorlieferanten verlangte Zertifizierung der Rohstoffe. Das BAX® PCR-System hatte sich in dem Untersuchungszeitraum bewährt und entspricht den Anforderungen für die Durchführung großer Probenvolumina, wie sie in einem Labor für die Lebensmittelherstellung benötigt werden. Es ist einfach zu handhaben, benötigt kurze Analysezeiten, liefert zuverlässige Resultate und entspricht der europäischen Norm und den nationalen Vorschriften gemäß §64 LFGB. Deshalb wurde dieses System nach Abschluss der vorliegenden Untersuchungen durch das mikrobiologische Labor des Lebensmittelherstellers übernommen, um es für Untersuchungen auf Salmonellen, L. monocytogenes, E. sakazakii und Staphylococcus aureus routinemäßig einzusetzen. Aufgrund der gesammelten Erkenntnisse wird das Umfeldmonitoring mit den durch die Untersuchung festgelegten sinnvollen Probenentnahmestellen in dem Lebensmittelbetrieb weiter fortgesetzt. Ergänzend dazu wird ein Luftkeimzählgerät in den betroffenen Arbeitsbereichen aufgestellt, um eine Belastung der Mikroorganismen in der Luft zu ermitteln.

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Wernsmann, Ruth Angela: Mikrobiologische Umgebungsuntersuchung bei der Herstellung von Säuglingsnahrung unter Berücksichtigung von Hygieneparametern, Enteobacter sakazakii, Listeria monocytogenes und Salmonellen. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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