Establishing a three-dimensional culture of canine corneal cells for in vitro studies on the effects of glucocorticoids

Die vorliegende Studie hatte zum Ziel, ein Modell zur Untersuchung von Medikamentenwirkungen an der Hundehornhaut zu entwickeln. Dazu gehörten die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung und Kultivierung primärer Hundehornhautzellen (Endothel, Keratozyten, Epithel) sowie die Konstruktion einer dreidimensionalen caninen Kornea-Zellkultur (Cornea-Equivalent). Die Untersuchung der Glukokortikoidwirkung erfolgte mittels Dexamethason. Aufgrund von Schwierigkeiten in der Kultur der primären Hundeepithelzellen, wurde zusätzlich eine Kaninchen-Epithelzelllinie (RCE Zellen) verwendet. Die beiden Zellarten wurden hinsichtlich ihrer Reaktion auf die Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) und Natrium Dodecylsulphat (SDS), die Behandlung mit Dexamethason sowie ihre Morphologie im Cornea-Equivalent untersucht. Canine Korneazellen wurden mittels kombinierter enzymatischer und mechanischer Methode isoliert und die verschiedenen Zelltypen mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie, Immunfluoreszenz und des Wester Blots verifiziert. Die Cornea-Equivalente wurden Schritt für Schritt in Membraneinsätzen in 6-well-Platten konstruiert. Während der ersten 3 Wochen erfolgte der Aufbau der einzelnen Schichten in submerser Kultur. In den letzen beiden Wochen der Kultur wurden die Cornea-Equivalente an die Luft-Medium-Grenze angehoben, um eine Differenzierung des Epithels zu ermöglichen. Als Epithel kamen entweder primäre Hundezellen oder die RCE Zellen zum Einsatz. Der Glukokortikoid Rezeptor (GR) wurde in den Hundehornhautzellen und den Cornea- Equivalenten mittels RT-PCR und Immunhistochemie untersucht. Die Stimulation der Einzelzellen (inklusive der RCE Zellen) und der Cornea-Equivalente erfolgte mittels LPS und SDS, behandelt wurde mit Dexamethason (1,0 und 0,01 μg/ml). Die Konzentration von PGE2, die im Verlauf einer Entzündungsreaktion ansteigt, wurde als Indikator für die Dexamethasonwirkung nach Stimulation gewählt. Dieses pro-inflammatorische Molekül wurde im Zellkulturüberstand untersucht. Die Isolation und Kultur der Hundehornhautzellen konnte in dieser Studie erfolgreich etabliert werden. Die drei Zelltypen wurden anhand oben erwähnter Kriterien identifiziert. Des Weiteren konnten die Primärzellen der Hornhaut erfolgreich in einem Cornea- Equivalent zusammengesetzt und über einen Zeitraum von 5 Wochen kultiviert werden. Der GR wurde sowohl in den einzeln kultivierten Hundehornhautzellen als auch in den caninen Cornea- Equivalenten nachgewiesen. Bei der Verwendung von RCE Zellen statt caniner Hornhautepithelzellen konnten morphologische Unterschiede in den Equivalenten festgestellt werden. Die Cornea-Equivalente die allein aus Hundezellen bestanden waren der Hundehornhaut in vivo ähnlicher. Bei den Hundeepithelzellen und Keratozyten führte eine Stimulation mit LPS zu einem PGE2 Anstieg. Bei den Hundeendothel und –epithelzellen hatte SDS den gleichen, wenngleich schwächeren Effekt. Die übrigen caninen Zelltypen reagierten auf die Stimulation nicht mit einem messbaren Anstieg an PGE2. Dexamethasone führte in den LPS-stimulierten Hundezellen zu einer dosisabhängigen Reduktion von PGE2. Bei den SDS-stimulierten Hundezellen hatte Dexamethason einen geringeren Effekt aufgrund erhöhter Streuung der Ergebnisse. Die RCE Zellen verhielten sich nicht vergleichbar mit den Hundeepithelzellen, da diese Zellen auf keinen der beiden Stimuli mit einem deutlichen PGE2 Anstieg reagierten. Bei den Cornea-Equivalenten führten beide Stimulationssubstanzen zu einem signifikanten Anstieg an PGE2, der in beiden Konzentrationen durch Dexamethason gehemmt wurde. Die Primärkultur der caninen Hornhautzellen und das Cornea-Equivalent stellen interessante Systeme zur Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf Hornhautzellen dar. Die Cornea- Equivalente reagieren sogar sensibler auf eine Stimulation und Dexamethasonbehandlung als die Einzelzellen. Der Einsatz beider Modelle könnte bei der Erforschung pathophysiologischer und therapeutischer Mechanismen bei Augenerkrankungen hilfreich sein. In der tiermedizinischen Ophthalmologie ist der Hund eine der am Häufigsten behandelten Tierarten und die Verfügbarkeit solcher Modelle sollte dazu beitragen, die Therapie von Augenkrankheiten in dieser Tierart zu verbessern.