Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Establishing a three-dimensional culture of canine corneal cells for in vitro studies on the effects of glucocorticoids

Werner, Anke Susanne

To provide a model to be used for in vitro studies on drug effects in dogs, the aim of this study was the establishing of a protocol for the primary culture of canine corneal cells (i.e. endothelium, keratocytes, and epithelium) and subsequently the construction of a three dimensional culture of canine corneal cells (cornea equivalent). To study the glucocorticoid effects on the three major cell types of the cornea, dexamethasone was used. Since difficulties in the culture of primary canine corneal cells arose, a rabbit epithelial cell line (RCE cell) was used additionally. Both cell types were compared in their reaction to LPS and SDS stimulation, effects of dexamethasone and morphological appearance on the cornea equivalent. Canine corneal cells were isolated using a combined enzymatic and mechanical technique. In culture, the different cell types were verified with phase contrast microscopy, immunofluorescense and western blotting. The cornea equivalent was constructed step by step in membrane inserts of a six-well plate. Stromal fibroblast in a collagen matrix were seeded onto a confluent endothelial cell layer and cultured for 6 – 8 days. Then either primary canine epithelial cells or RCE cells were added and grown to confluence in a submerged culture. Finally, the equivalent was lifted to the air-liquid-interface for two more weeks to allow a differentiation of the epithelial cells. The glucocorticoid receptor (GR) was investigated in the primary canine corneal cells and the equivalents using RT-PCR and immunohistochemistry. The single cells (including RCE cells) and the cornea equivalents were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and sodium dodecyl sulfate (SDS) and treated with dexamethasone (1.0 and 0.01 μg/ml). The PGE2 concentration, which increases during an inflammatory reactions, was chosen as an indicator to study the effects of dexamethasone after such stimulation. This pro-inflammatory molecule was studied in the culture medium of single cultures of the three major cell types of the canine cornea, of RCE cells as well as in the canine cornea equivalents. A protocol for the isolation and culture of canine corneal cells was successfully established in this study, and the identity of the cells was verified. The three cell types were successfully reassembled in a vital cornea equivalent which was cultured for a total of five weeks. The GR was detected in both the cultured canine cells and the canine cornea equivalents. The use of RCE cells instead of canine corneal cells in the construction of the cornea equivalents revealed morphological differences. The equivalents constructed with primary canine cells resembled the canine cornea in vivo more closely. An increased PGE2 concentration was measured in canine epithelial cells and keratocytes after the stimulation with LPS and in canine epithelial cells and endothelial following stimulation with SDS. Dexamethasone reduced the LPS-induced PGE2 production in a dose-dependent manner. The SDS-induced PGE2 concentration was less clearly reduced by dexamethasone, caused by a higher variance of the results. The RCE cells did not react similarly to the primary canine epithelial cells since both stimuli failed to induce an increase in PGE2. In the cornea equivalents, both stimuli led to a significant increase in PGE2 which could be reduced in a dose-dependent manner by both dexamethasone concentrations tested. The primary culture of the canine corneal cells and the cornea equivalent are interesting systems to test drug effects on corneal cells. The cornea equivalents were even more sensitive to the stimulation and dexamethasone treatment than the single cell cultures. Studies using single cell cultures and the equivalent may reveal further insights on pathophysiological and therapeutic mechanisms in ocular disease. As the dog is one of the species most often treated in veterinary ophthalmology, such models should help improve the treatment of ocular disorders in this species.

Die vorliegende Studie hatte zum Ziel, ein Modell zur Untersuchung von Medikamentenwirkungen an der Hundehornhaut zu entwickeln. Dazu gehörten die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung und Kultivierung primärer Hundehornhautzellen (Endothel, Keratozyten, Epithel) sowie die Konstruktion einer dreidimensionalen caninen Kornea-Zellkultur (Cornea-Equivalent). Die Untersuchung der Glukokortikoidwirkung erfolgte mittels Dexamethason. Aufgrund von Schwierigkeiten in der Kultur der primären Hundeepithelzellen, wurde zusätzlich eine Kaninchen-Epithelzelllinie (RCE Zellen) verwendet. Die beiden Zellarten wurden hinsichtlich ihrer Reaktion auf die Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) und Natrium Dodecylsulphat (SDS), die Behandlung mit Dexamethason sowie ihre Morphologie im Cornea-Equivalent untersucht. Canine Korneazellen wurden mittels kombinierter enzymatischer und mechanischer Methode isoliert und die verschiedenen Zelltypen mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie, Immunfluoreszenz und des Wester Blots verifiziert. Die Cornea-Equivalente wurden Schritt für Schritt in Membraneinsätzen in 6-well-Platten konstruiert. Während der ersten 3 Wochen erfolgte der Aufbau der einzelnen Schichten in submerser Kultur. In den letzen beiden Wochen der Kultur wurden die Cornea-Equivalente an die Luft-Medium-Grenze angehoben, um eine Differenzierung des Epithels zu ermöglichen. Als Epithel kamen entweder primäre Hundezellen oder die RCE Zellen zum Einsatz. Der Glukokortikoid Rezeptor (GR) wurde in den Hundehornhautzellen und den Cornea- Equivalenten mittels RT-PCR und Immunhistochemie untersucht. Die Stimulation der Einzelzellen (inklusive der RCE Zellen) und der Cornea-Equivalente erfolgte mittels LPS und SDS, behandelt wurde mit Dexamethason (1,0 und 0,01 μg/ml). Die Konzentration von PGE2, die im Verlauf einer Entzündungsreaktion ansteigt, wurde als Indikator für die Dexamethasonwirkung nach Stimulation gewählt. Dieses pro-inflammatorische Molekül wurde im Zellkulturüberstand untersucht. Die Isolation und Kultur der Hundehornhautzellen konnte in dieser Studie erfolgreich etabliert werden. Die drei Zelltypen wurden anhand oben erwähnter Kriterien identifiziert. Des Weiteren konnten die Primärzellen der Hornhaut erfolgreich in einem Cornea- Equivalent zusammengesetzt und über einen Zeitraum von 5 Wochen kultiviert werden. Der GR wurde sowohl in den einzeln kultivierten Hundehornhautzellen als auch in den caninen Cornea- Equivalenten nachgewiesen. Bei der Verwendung von RCE Zellen statt caniner Hornhautepithelzellen konnten morphologische Unterschiede in den Equivalenten festgestellt werden. Die Cornea-Equivalente die allein aus Hundezellen bestanden waren der Hundehornhaut in vivo ähnlicher. Bei den Hundeepithelzellen und Keratozyten führte eine Stimulation mit LPS zu einem PGE2 Anstieg. Bei den Hundeendothel und –epithelzellen hatte SDS den gleichen, wenngleich schwächeren Effekt. Die übrigen caninen Zelltypen reagierten auf die Stimulation nicht mit einem messbaren Anstieg an PGE2. Dexamethasone führte in den LPS-stimulierten Hundezellen zu einer dosisabhängigen Reduktion von PGE2. Bei den SDS-stimulierten Hundezellen hatte Dexamethason einen geringeren Effekt aufgrund erhöhter Streuung der Ergebnisse. Die RCE Zellen verhielten sich nicht vergleichbar mit den Hundeepithelzellen, da diese Zellen auf keinen der beiden Stimuli mit einem deutlichen PGE2 Anstieg reagierten. Bei den Cornea-Equivalenten führten beide Stimulationssubstanzen zu einem signifikanten Anstieg an PGE2, der in beiden Konzentrationen durch Dexamethason gehemmt wurde. Die Primärkultur der caninen Hornhautzellen und das Cornea-Equivalent stellen interessante Systeme zur Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf Hornhautzellen dar. Die Cornea- Equivalente reagieren sogar sensibler auf eine Stimulation und Dexamethasonbehandlung als die Einzelzellen. Der Einsatz beider Modelle könnte bei der Erforschung pathophysiologischer und therapeutischer Mechanismen bei Augenerkrankungen hilfreich sein. In der tiermedizinischen Ophthalmologie ist der Hund eine der am Häufigsten behandelten Tierarten und die Verfügbarkeit solcher Modelle sollte dazu beitragen, die Therapie von Augenkrankheiten in dieser Tierart zu verbessern.

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Werner, Anke Susanne: Establishing a three-dimensional culture of canine corneal cells for in vitro studies on the effects of glucocorticoids. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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