Experimentelle Infektion von TNF-transgenen Mäusen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit

Ziel dieser Arbeit war es, durch eine transgen induzierte variable Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF)-Überexpression potenzielle degenerative und protektive Effekte im ZNS im Rahmen der murinen BDV-Infektion zu modulieren und zu charakterisieren, wobei zudem erstmals das Zytokinprofil bei der BDV-infizierten Maus analysiert werden sollte. Dazu wurden hetero- und homozygote TNF-transgene Mäuse mit einer moderaten neuronalen TNF-Überexpression und nicht transgene Tiere gleichen genetischen Hintergrunds neonatal mit einer mausadaptierten BDV-Präparation intrazerebral infiziert. Nach der Sektion wurden zunächst die pathohistologischen Veränderungen der Mäusegehirne ausgewertet und immunhistologisch das virale Nukleoprotein (BDV-N) dargestellt. Zum Ausschluss eines eventuellen Einflusses der BDV-Infektion auf die Expression des Promotors des Transgens wurde die mRNA des NR2B-Rezeptors mittels real-time RT-PCR quantifiziert. Degenerative Veränderungen wurden im Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnitt festgestellt. Dabei wurden sowohl apoptotische bzw. nekrotische Zellen, als auch Vakuolisierungen im Gehirngewebe berücksichtigt. Die Vakuolen wurden weiterhin mittels Elektronenmikroskopie genauer untersucht. Anschließend wurde anhand der Immunhistologie die Expression verschiedener Proteine, die hinweisend auf degenerative (Caspase 3, TUNEL-Methode) oder protektive (p50, BDNF, ADNP) Prozesse sind, wie auch die TNF-Rezeptoren 1 und 2 bestimmt. Zudem wurde der Zellkerndurchmesser GFAP-positiver Zellen als Zeichen des Aktivierungsgrades am Tag 42 p.i. gemessen. Abschließend wurde mittels real-time RT-PCR noch die mRNA von IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, TGFβ1, IFNγ, TNF, TNFR1, TNFR2 und BDNF im Vorderhirn und teilweise in den Gehirnregionen Cortex cerebri, Striatum, Hippocampus und Cerebellum gemessen. In allen drei BDV-infizierten Mausgruppen konnte eine disseminierte Verteilung des viralen Proteins BDV-N im Gehirn ab Tag 21 p.i. bis zum Ende der Untersuchung festgestellt werden. In Bezug auf die Entzündungszellreaktion fand sich eine deutliche Korrelation mit dem transgenen Status der Tiere. Die nicht transgenen Tiere zeigten eine geringgradige Entzündungszellinfiltration ohne Progression im Verlauf der Studie, dagegen war in beiden transgenen Mausgruppen ein signifikanter Anstieg des Schweregrades der Meningoenzephalitis bis zum Tag 42 p.i. mit Läsionen vorwiegend in den TNF-exprimierenden Arealen, ausgenommen dem Ammonshorn, weiterhin wurde eine korrespondierende Mikroglia- und Astrozytenaktivierung festgestellt. In den TNF-transgenen Tieren wurde nach der BDV-Infektion eine Zunahme von p50-, ADNP-, TNFR1- und TNFR2-positive Zellen ermittelt. Zudem fand sich in den TNF-transgenen Tieren nach der BDV-Infektion eine Zunahme von apoptotischen Zellen mit und ohne Caspase 3-Expression. Bei den Caspase 3-negativen Zellen handelte es sich vorwiegend um GFAP-positive Astrozyten. Allerdings wurden keine neuronalen Nekrosen im Ammonshorn detektiert, die üblicherweise bei einer BDV-Infektion gefunden werden. Weiterhin wurde als degenerativer Prozess eine Vakuolisierung nachgewiesen, die sowohl bei den nicht transgenen als auch bei den transgenen Tieren nach BDV-Infektion vorlag. Die elektronenmikroskopische Untersuchung deutete auf eine primäre Myelinscheidenschwellung als Ursache für die Vakuolen im Gehirn hin. Einen unerwarteten Befund stellte die selektiv im Ammonshorn vorkommende Zunahme der BDNF mRNA bei transgenen BDV-infizierten Tieren dar, welche nicht mit einer Zunahme von BDNF-positiven Zellen einherging. So scheinen regional verschiedene Prozesse nach BDV-Infektion und TNF-Überexpression wirksam zu sein, die im Ammonshorn eher protektive und im Cortex cerebri und Striatum eher degenerative Veränderungen induzieren. Bei der Messung der Gesamt-TNF mRNA-Menge waren die Werte der tg+/+ ungefähr doppelt so hoch wie bei den tg+/-. Zudem war eine Induktion des endogenen TNF durch das transgene TNF festzustellen, da die Kopienzahlen des transgenem TNF nur 40-70% des totalem TNF entsprachen. Eine signifikante Erhöhung der TNF mRNA durch die BDV-Infektion war bei den transgenen Mäusen überraschenderweise nicht zu ermitteln. Durch die BDV-Infektion kam es vor allem bei den transgenen Tieren im Rahmen der entzündlichen Reaktion zu einem signifikanten Anstieg sowohl von TNFR1 und TNFR2-positiven Zellen als auch von TNFR1 und TNFR2 mRNA. Dies deutet darauf hin, dass die Wirkung des TNF eventuell nicht durch die Hochregulation des TNF an sich sondern durch eine Aktivierung der Rezeptoren erreicht wird. Bei den übrigen Zytokine wurde eine Aufregulation von IL-1α, IL-6 und IFNγ sowie bei den nicht transgenen Tieren von TNF nach der BDV-Infektion festgestellt. Zwar führte die BDV-Infektion bei den transgenen Tieren nicht zu einer weiteren Aufregulation von TNF, allerdings waren diese Werte per se signifikant höher im Vergleich zu den nicht transgenen Tieren. Nach BDV-Infektion war das Zytokinprofil durch die TNF-Überexpression und den damit verbundenen starken entzündlichen Reaktion nicht grundlegend verändernt. Überraschenderweise wurde keine Erhöhung der Interleukine IL-2 und IL-12 mRNA nachgewiesen, was auf eine unvollständige Th1 abhängige Immunantwort hindeuten kann. Zusammenfassend zeigte die vorliegenden Studie, dass eine TNF-Überexpression zu keiner Veränderung des Zytokinprofils nach der BDV-Infektion führt, aber zu einer früheren und stärkeren Aufregulation der proinflammatorischen Zytokine. Andererseits konnten sowohl Hinweise auf eine regionenspezifische neuroprotektive Wirkung im Ammonshorn als auch vermehrte Caspase 3-abhängige und –unabhängige Zelluntergänge im Cortex cerebri und Striatum gewonnen werden. Weiterhin ergab sich eine Vakuolisierung im Gehirn, die initial auf eine primäre Myelinscheidenschwellung zurückzuführen ist. Die TNF-Überexpression in Verbindung mit einer BDV-Infektion stellt somit ein sehr gutes Modell zur Untersuchung weiterer regionspezifischer Interaktion von Zytokinen mit neuroprotektiven Faktoren und der Immunreaktion dar.