Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Infektion von TNF-transgenen Mäusen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit

Schaudien, Dirk

The aim of the present study was to analyze the influence of a transgenically induced overexpression of the proinflammatory cytokine tumor necrosis factor-α (TNF) on potential degenerative or protective effects after infection with the neurotropic Borna Disease Virus (BDV). Additionally, the cytokine profile was measured in mice after BDV-infection with and without TNF-overexpression. Homo- (tg+/+) and heterozygous (tg+/-) transgenic animals with a moderate neuronal TNF-overexpression and non-transgenic neonatal animals with the same genetic background were infected intracerebrally with a mouse adapted BDV-strain. After necropsy, the mice brains were analyzed for the presence of pathohistological lesions. The viral nucleoprotein (BDV-N) expression was investigated immunhistologically. Furthermore, a possible influence on the promotor of the transgene via the BDV-infection was excluded by investigating the NR2B mRNA expression using real-time RT-PCR. Possible degenerative including apoptotic or necrotic cells or vacuolization were analyzed on hematoxylin and eosin-stained brain sections. In addition, vacuolization was examined by electron microscopy in detail. In addition, degenerative (Caspase 3, TUNEL-assay) and protective (p50, BDNF, ADNP) factors as well as TNF receptor 1 and 2 expression were investigated using immunohistochemistry. To study cellular activation, the nuclear diameter of GFAP-positive cells were determined 42 days after infection. Moreover, mRNA of IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, TGFβ1, IFNγ, TNF, TNFR1, TNFR2 and BDNF was quantified by real time RT-PCR in the forebrain and selectively in Cortex cerebri, striatum, hippocampus and cerebellum. The viral protein BDV-N showed a disseminated distribution within the brain in all three BDV-infected mice groups starting at day 21 p.i. The inflammatory reaction correlated strongly with the transgenic status of the animals. Non-transgenic mice showed a mild cellular infiltration without progression during the investigation period. In contrast, the inflammatory reaction in both TNF-overexpressing transgenic mice groups caused a progressive, severe nonpurulent meningoencephalitis. In addition, activation of microglia and astrogliosis was observed. After BDV-infection, the total number of cells positive for p50, ADNP, TNFR1 and TNFR2 was increased in TNF-transgenic mice. Few apoptotic cells with features of activated astrocytes adjacent to inflammatory infiltrates in BDV-infected tg mice were detected. In transgenic BDV-infected mice, the amount of Caspase 3-positive and TUNEL-positive cells was significantly up-regulated. Surprisingly, most of the GFAP-positive cells showing apoptosis-like chromatin condensation lacked Caspase 3 immunoreactivity. However, neuronal necrosis, normally seen after BDV-infection, was not detected. Moreover, a moderate to severe vacuolization was noted in the brain beginning 35 days after BDV-infection. Interestingly, there was no significant difference between transgenic and non-transgenic BDV-infected mice. Electronmicroscopic examination revealed edema of the myelin sheath. Surprisingly, BDNF mRNA transcripts were significantly up-regulated in the hippocampus in hetero- and homozygous TNF-transgenic BDV-infected mice compared to non-infected and non-transgenic BDV-infected mice. However, there was no correlation with an increase of BDNF-positive cells after BDV-infection in the hippocampus. The basic levels of TNFto and TNFtg mRNA were approximately 2 fold higher in homozygous than in heterozygous animals and significantly increased compared to ntg mice. Interestingly, TNFtg induced an upregulation of host-derived TNF mRNA. After BDV-infection, no significant increase of TNFto mRNA values in transgenic mice was detected. However, TNFR1 and TNFR2 mRNA levels was significantly up-regulated until day 42 p.i. in all infected mice groups. This was more obvious in homozygous mice. After BDV-infection, the number of TNFR1- and TNFR2-positive cells increased significantly. This was most evident in both transgenic BDV-infected mice groups. This finding indicates that TNF-effects were mediated by increased receptor availability and not by further up-regulation of TNF itself. Elevated mRNA transcripts such as IL-1α, IL-6, IFNγ and IL-10 were measured in all BDV-infected mice compared to the non-infected control . However, total mRNA values were significantly higher in tg than in ntg mice. IL-2, IL-4, IL-5, IL-12 and TGFβ1 mRNA was not up-regulated after BDV-infection in any group. Though cytokine transcripts were more elevated in tg mice after BDV-infection, the general cytokine expression profile remained unchanged. The lack of IL-2 and IL-12 mRNA up-regulation indicates an incomplete Th1 response. This study shows that TNF-overexpression did not lead to a change in the cytokine profile after BDV-infection. However, a more pronounced and earlier upregulation of proinflammatory cytokine mRNA was detected. Furthermore, region specific neuroprotective effects in the hipoocampus as well as increased degenerative changes in the cortex cerebri and striatum were present. In conclusion, TNF-overexpression in combination with BDV-infection represents an excellent model to study further region-specific interactions of cytokines with neuroprotective factors and the antiviral immune response.

Ziel dieser Arbeit war es, durch eine transgen induzierte variable Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF)-Überexpression potenzielle degenerative und protektive Effekte im ZNS im Rahmen der murinen BDV-Infektion zu modulieren und zu charakterisieren, wobei zudem erstmals das Zytokinprofil bei der BDV-infizierten Maus analysiert werden sollte. Dazu wurden hetero- und homozygote TNF-transgene Mäuse mit einer moderaten neuronalen TNF-Überexpression und nicht transgene Tiere gleichen genetischen Hintergrunds neonatal mit einer mausadaptierten BDV-Präparation intrazerebral infiziert. Nach der Sektion wurden zunächst die pathohistologischen Veränderungen der Mäusegehirne ausgewertet und immunhistologisch das virale Nukleoprotein (BDV-N) dargestellt. Zum Ausschluss eines eventuellen Einflusses der BDV-Infektion auf die Expression des Promotors des Transgens wurde die mRNA des NR2B-Rezeptors mittels real-time RT-PCR quantifiziert. Degenerative Veränderungen wurden im Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnitt festgestellt. Dabei wurden sowohl apoptotische bzw. nekrotische Zellen, als auch Vakuolisierungen im Gehirngewebe berücksichtigt. Die Vakuolen wurden weiterhin mittels Elektronenmikroskopie genauer untersucht. Anschließend wurde anhand der Immunhistologie die Expression verschiedener Proteine, die hinweisend auf degenerative (Caspase 3, TUNEL-Methode) oder protektive (p50, BDNF, ADNP) Prozesse sind, wie auch die TNF-Rezeptoren 1 und 2 bestimmt. Zudem wurde der Zellkerndurchmesser GFAP-positiver Zellen als Zeichen des Aktivierungsgrades am Tag 42 p.i. gemessen. Abschließend wurde mittels real-time RT-PCR noch die mRNA von IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, TGFβ1, IFNγ, TNF, TNFR1, TNFR2 und BDNF im Vorderhirn und teilweise in den Gehirnregionen Cortex cerebri, Striatum, Hippocampus und Cerebellum gemessen. In allen drei BDV-infizierten Mausgruppen konnte eine disseminierte Verteilung des viralen Proteins BDV-N im Gehirn ab Tag 21 p.i. bis zum Ende der Untersuchung festgestellt werden. In Bezug auf die Entzündungszellreaktion fand sich eine deutliche Korrelation mit dem transgenen Status der Tiere. Die nicht transgenen Tiere zeigten eine geringgradige Entzündungszellinfiltration ohne Progression im Verlauf der Studie, dagegen war in beiden transgenen Mausgruppen ein signifikanter Anstieg des Schweregrades der Meningoenzephalitis bis zum Tag 42 p.i. mit Läsionen vorwiegend in den TNF-exprimierenden Arealen, ausgenommen dem Ammonshorn, weiterhin wurde eine korrespondierende Mikroglia- und Astrozytenaktivierung festgestellt. In den TNF-transgenen Tieren wurde nach der BDV-Infektion eine Zunahme von p50-, ADNP-, TNFR1- und TNFR2-positive Zellen ermittelt. Zudem fand sich in den TNF-transgenen Tieren nach der BDV-Infektion eine Zunahme von apoptotischen Zellen mit und ohne Caspase 3-Expression. Bei den Caspase 3-negativen Zellen handelte es sich vorwiegend um GFAP-positive Astrozyten. Allerdings wurden keine neuronalen Nekrosen im Ammonshorn detektiert, die üblicherweise bei einer BDV-Infektion gefunden werden. Weiterhin wurde als degenerativer Prozess eine Vakuolisierung nachgewiesen, die sowohl bei den nicht transgenen als auch bei den transgenen Tieren nach BDV-Infektion vorlag. Die elektronenmikroskopische Untersuchung deutete auf eine primäre Myelinscheidenschwellung als Ursache für die Vakuolen im Gehirn hin. Einen unerwarteten Befund stellte die selektiv im Ammonshorn vorkommende Zunahme der BDNF mRNA bei transgenen BDV-infizierten Tieren dar, welche nicht mit einer Zunahme von BDNF-positiven Zellen einherging. So scheinen regional verschiedene Prozesse nach BDV-Infektion und TNF-Überexpression wirksam zu sein, die im Ammonshorn eher protektive und im Cortex cerebri und Striatum eher degenerative Veränderungen induzieren. Bei der Messung der Gesamt-TNF mRNA-Menge waren die Werte der tg+/+ ungefähr doppelt so hoch wie bei den tg+/-. Zudem war eine Induktion des endogenen TNF durch das transgene TNF festzustellen, da die Kopienzahlen des transgenem TNF nur 40-70% des totalem TNF entsprachen. Eine signifikante Erhöhung der TNF mRNA durch die BDV-Infektion war bei den transgenen Mäusen überraschenderweise nicht zu ermitteln. Durch die BDV-Infektion kam es vor allem bei den transgenen Tieren im Rahmen der entzündlichen Reaktion zu einem signifikanten Anstieg sowohl von TNFR1 und TNFR2-positiven Zellen als auch von TNFR1 und TNFR2 mRNA. Dies deutet darauf hin, dass die Wirkung des TNF eventuell nicht durch die Hochregulation des TNF an sich sondern durch eine Aktivierung der Rezeptoren erreicht wird. Bei den übrigen Zytokine wurde eine Aufregulation von IL-1α, IL-6 und IFNγ sowie bei den nicht transgenen Tieren von TNF nach der BDV-Infektion festgestellt. Zwar führte die BDV-Infektion bei den transgenen Tieren nicht zu einer weiteren Aufregulation von TNF, allerdings waren diese Werte per se signifikant höher im Vergleich zu den nicht transgenen Tieren. Nach BDV-Infektion war das Zytokinprofil durch die TNF-Überexpression und den damit verbundenen starken entzündlichen Reaktion nicht grundlegend verändernt. Überraschenderweise wurde keine Erhöhung der Interleukine IL-2 und IL-12 mRNA nachgewiesen, was auf eine unvollständige Th1 abhängige Immunantwort hindeuten kann. Zusammenfassend zeigte die vorliegenden Studie, dass eine TNF-Überexpression zu keiner Veränderung des Zytokinprofils nach der BDV-Infektion führt, aber zu einer früheren und stärkeren Aufregulation der proinflammatorischen Zytokine. Andererseits konnten sowohl Hinweise auf eine regionenspezifische neuroprotektive Wirkung im Ammonshorn als auch vermehrte Caspase 3-abhängige und –unabhängige Zelluntergänge im Cortex cerebri und Striatum gewonnen werden. Weiterhin ergab sich eine Vakuolisierung im Gehirn, die initial auf eine primäre Myelinscheidenschwellung zurückzuführen ist. Die TNF-Überexpression in Verbindung mit einer BDV-Infektion stellt somit ein sehr gutes Modell zur Untersuchung weiterer regionspezifischer Interaktion von Zytokinen mit neuroprotektiven Faktoren und der Immunreaktion dar. 

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Schaudien, Dirk: Experimentelle Infektion von TNF-transgenen Mäusen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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