Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Functional analysis of the Interleukin-10 (IL-10) network by induction of colitis in conditional IL-10 and IL-10 receptor knock-out mice

Greweling, Marina Christiane

Elucidation of the cellular interleukin-10 (IL-10) network is an important issue for understanding how IL-10 regulates inflammatory responses. The comprehension of such regulatory mechanisms might help find a way to limit the immune response in a chronic inflammation such as Inflammatory Bowel Disease (IBD). The generation and analysis of conditional knock-out mice is a way to demonstrate the cell specific function of a gene in the context of an entire organism. The work in this thesis involves the establishment of 3 conditional IL-10 receptor (IL-10R) mouse strains and the development of a colitis model in order to analyse these strains and conditional IL-10 knock-out mouse strains in addition, for their susceptibility to colitis. In the first part, 3 conditional IL-10R knock-out mouse strains, specific for B-cells, T-cells and macrophages and neutrophils, were bred and the efficiency and the specificity of the deletion was confirmed by Southern blot analysis of sorted cell populations. Furthermore, a mouse strain carrying the ubiquitous IL-10R knock-out (IL-10-/-) was established. The evaluation of a colitis model was the next step conducted, because IL-10 complete knock-out mice maintained at the Helmholtz Centre for Infection Research were found to be devoid of signs of colitis. Induction of colitis using dextran sulfate sodium (DSS) was found to be a suitable model and gave the following results: IL-10-/- mice developed a severe acute suppurative colitis, whereas wildtype mice exhibited only a mild colitis. The cytokine profile in IL-10-/- mice was characterised by proinflammatory cytokines and chemokines. These results demonstrate the induction of an innate immune response by DSS and its inhibition by IL-10. In order to elucidate the role of the intestinal bacteria in DSS induced colitis, germfree mice were exposed to DSS. Surprisingly, germfree wildtype as well as IL-10-/- mice were even more susceptible to DSS than IL-10-/- mice harbouring intestinal flora. This implies that intestinal bacteria are protective against DSS induced damage and that the protective effect is mediated by IL-10. Hence, DSS causes colitis through a toxic effect to the intestinal epithelial cells. The analysis of the mouse strains carrying a cell type specific deletion of the IL-10R in B-cells, T-cells and macrophages and neutrophils in the DSS colitis model did not reveal significant differences to wildtype controls. The mixed genetic background of the animals might be the cause for the large deviation observed. A backcross of the three conditional IL-10R mouse strains to C57BL/6 might reveal differences that were masked by the background effect in this thesis. The exposure of T-cell and macrophage and neutrophil specific conditional IL-10 knock-out mice to DSS did not reveal significant differences, either. Mice carrying the specific deletion of IL-10 in T-cells though, exhibited a tendency towards an enhanced susceptibility to DSS. In order to elucidate the role of T-cell derived IL-10 in a Th1 or Th2 dominated immune response upon DSS exposure, double knock-out mice carrying the deletion of IL-10 in T-cells and the complete knock-out of IL-4 or IL-12 in addition, were analysed in the DSS colitis model. Unexpectedly, the lack of IL-12 led to an increased susceptibility to DSS induced colitis. The lack of T-cell derived IL-10 in combination with the lack of IL-4 increased the susceptibility to DSS induced colitis as well. Hence, a T helpercell immune response seems to down-regulate the innate immune response to DSS induced damage of the epithelium, independent of a Th1 or Th2 polarisation. In conclusion the data obtained in this study indicate that DSS causes damage to the intestinal epithelium due to a toxic effect, thereby inducing an innate immune response. This innate immune response is inhibited by IL-10. The main IL-10 producing cells are most probably T-cells that are induced by intestinal bacteria. The most important target cell of IL-10 was not found in this study, the cytokine profile of an innate immune response though, suggests a crucial role of macrophages and neutrophils or intestinal epithelial cells. The analysis of the recently available mouse strain carrying the Cre-transgene for intestinal epithelial cells would be of interest in the DSS colitis model. Furthermore, the role of dendritic cells in this model remains to be determined.

Die Analyse des Interleukin-10 (IL-10) Netzwerkes ist notwendig um zu verstehen, wie IL-10 Entzündungsreaktionen reguliert. Das bessere Verständnis solcher immuno-regulatorischen Mechanismen kann helfen, Immunantworten, die chronischen Entzündungen wie z.B chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zugrunde liegen, einzudämmen. Ziel dieser Arbeit war es, anhand der Analyse konditionaler IL-10 Rezeptor (IL-10R) knock-out Mäuse die Funktion von IL-10 auf T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen und Neutrophile im Hinblick auf die Entwicklung einer IBD zu untersuchen. Des Weiteren sollte die Analyse konditionaler IL-10 knock-out Mäuse zeigen, ob von T-Zellen oder von Makrophagen und Neutrophilen produziertes IL-10 die Entwicklung von IBD verhindert. Dazu wurden zunächst drei konditionale IL-10R knock-out sowie eine IL-10R komplett knock-out Mauslinien gezüchtet und anschließend die Effizienz und Zellspezifität der Deletion des IL-10R mittels einer Southern-Blot-Analyse von FACS sortierten Zellpopulationen nachgewiesen. Da die am Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung gehaltenen IL-10 defizienten Mäuse keine spontane Darmentzündung zeigten, wurde durch Verabreichung von Dextran Sodium Sulphat (DSS) eine Kolitis ausgelöst. Das DSS Modell ergab folgende Ergebnisse: IL-10-/- Mäuse entwickelten eine hochgradige akut eitrige Kolitis, während wildtyp Mäuse nur eine geringgradige Kolitis zeigten. Das Zytokinprofil in IL-10-/- Mäusen war charakterisiert durch proinflammatorische Zytokine und Chemokine. Die Induktion einer angeborenen Immunantwort durch DSS und deren Hemmung durch IL-10 konnte damit gezeigt werden. Um zu untersuchen ob die Darmentzündung in IL-10-/- Mäusen durch kommensale Darmbakterien ausgelöst wird, wurden keimfreie Mäuse mit DSS behandelt. Unerwarteter Weise zeigten keimfreie Mäuse eine dramatischere Darmentzündung als IL-10-/- Mäuse mit normaler Darmflora, unabhängig davon ob sie den IL-10 Knock-out trugen oder nicht. DSS löst demnach eine Darmentzündung durch einen direkten toxischen Effekt auf das Darmepithel aus. Darmbakterien schützen vor der Schädigung durch DSS durch einen IL-10 vermittelten Effekt. Bei der Analyse der konditionalen IL-10R knock-out Mutanten konnte kein eindeutiger Unterschied zu den Kontrolltieren in den drei untersuchten Linien festgestellt werden. Der Grund dafür könnte in dem gemischten genetischen Hintergrund der Tiere zu finden sein. Eine Wiederholung des DSS Versuches mit den drei Linien nach Rückkreuzung auf C57BL/6 könnte Unterschiede hervorbringen. Die Analyse der konditionalen knock-out Mäuse für IL-10 in T-Zellen bzw. Makrophagen und Neutrophile im DSS Modell ergab ebenfalls keine signifikanten Unterschiede, wobei Tiere mit einem konditionalen Knock-out von IL-10 in T-Zellen eine Tendenz zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber DSS zeigten. Die Analyse von Doppel-knock-out Mutanten, die zusätzlich zu der IL-10 Defizienz in T-Zellen einen Knock-out von IL-12 oder IL-4 trugen, wurde durchgeführt um zu untersuchen, ob IL-10 produzierende T-Zellen in der Lage sind, eine vorherrschende Th1 oder Th2 Immunantwort im DSS Modell zu begrenzen. Unerwarteter Weise löste bereits das Fehlen von IL-12 eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber DSS aus. Das Fehlen von IL-10 in T-Zellen in Kombination mit dem Fehlen von IL-4 führte ebenfalls zu einer erhöhten Empfindlichkeit. Eine T-Helferzell-Immunantwort, unabhängig ob sie Th1 oder Th2 polarisiert ist scheint demnach die angeborene Immunantwort auf die Schädigung des Epithels durch DSS zu regulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass DSS eine toxische Schädigung des Epithels verursacht, die eine angeborene Immunantwort auslöst, welche durch IL-10 gehemmt wird. Die IL-10 produzierenden Zellen sind wahrscheinlich T-Zellen, deren Aktivität von Darmbakterien abhängig ist. Welche die wichtigste Zielzelle von IL-10 in diesem Modell ist, konnte nicht beantwortet werden. Das Zytokinprofil der angeborenen Immunantwort weist jedoch auf Makrophagen und Neutrophile oder Epithelzellen als wichtigste Zielzellen hin. Seit kurzem sind auch Cre-transgene Mauslinien für Darmepithelzellen verfügbar, deren Analyse in diesem Experiment von Interesse wäre. Des Weiteren bleibt die Rolle der dendritischen Zellen noch zu klären.

Quote

Citation style:

Greweling, Marina Christiane: Functional analysis of the Interleukin-10 (IL-10) network by induction of colitis in conditional IL-10 and IL-10 receptor knock-out mice. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export