Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Durchflusszytometrische Bestimmungen von probiotischen Starterkulturen unter besonderer Berücksichtigung von Laktobazillen und Bifidobakterien

Ahlfeld, Birte

The popularity of probiotic products has been increasing worldwide. Microorganisms with health-related sproperties represent an economically important fraction of these products. A content of 106 cfu/g product is considered to be a prerequisite for any physiological probiotic effect. The total bacterial count of probiotic bacteria has been done culturally on elective and/or selective media so far. However, a standard method has not been established yet. As culturing is time-consuming, a rapid method for a quantitative determination of bacteria would be desirable. Therefore, 10 strains of Lactobacillus (L.) spp., 7 of Bifidobacterium (B.) spp., one of Escherichia (E.) coli as well as cultures from 10 flavoured milks and 3 pharmaceutical preparations (two monocultures with E. coli, and one mixed culture containing L. paracasei, L. acidophilus, Bifidobacterium spp., and Lactococcus lactis) were considered for the present survey. Monocultures were suspended in either pure bouillon or in bouillon containing 25 % milk (0.3 and 3.5 % fat) and were stored for 42 days at 4 °C, as were some of the flavoured milk products. Samples were evaluated on day 1, 21 and 42. Pharmaceutical preparations were analysed five times at monthly intervals. Analysis were carried out in parallel in a flow cytometer (FACSCalibur®, Becton Dickinson) using the fluorescent dyes SYTO®9 (live/dead staining), TO-PRO®-3 and PJ (dead staining), and via the surface spatula method (OSV) on a series of elective and selective media (MRS, MRS-V, MUP, X-Glu, RCM, M-17, PC). Quantification by FACS was achieved adding a known quantity of beads (PeakFlow™ Orange flow cytometry reference beads 2.5 µm, 1.2 x 108) to a known volume. This allowed the enumeration of bacteria present in a given sample. During the 42 days of storage, bacterial vitality in monocultures and milk products was deter-mined via flow cytometry and was compared to the changes in the bacterial counts detected during conventional culturing. The fluorescent dyes permitted the differentiation between vital and dead bacteria as well as the determination of these parameters on a percentage level. The method of quantifying bacteria via FACS and using beads (triple set of solutions per sample) was established subsequently. Pure cultures and monoculture from one product were further investigated in order to assess a limit of detection. Determination of bacterial counts of pure cultures with and without milk additive as well as of flavoured milk products was carried out during the 42-days storage phase. The data obtained were constantly compared to the bacterial counts resulting from the OSV method (double set of solutions per sample). During the analysis of the 12 pure cultures, bacterial counts as determined via OSV decreased while the amount of dead bacteria detected by FACS increased in parallel. 9 strains, e.g. L. casei (S-16) and B. animalis (S-4) yielded constant amounts or slight reductions in the percentage of dead bacteria and bacterial counts (reduction of viable bacteria by 2.7 – 23.0 %, |∆ BC| = 0.02 - 1.51 lg cfu/ml). With 3 strains, e.g. L. johnsonii (S-14) and B. longum (S-7), a marked decrease in vitality and bacterial counts was observed (reduction of viable bacteria by 67.3 – 79.7 %, |∆ BC| = 3.68 - 8.08 lg cfu/ml). While analysing the flavoured milk products, results obtained via OSV showed that strains of L. casei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium sp. and S. thermophilus, remained at a very stable level during storage (|∆ BC| ≤ 0.7 lg cfu/ml). The case of L. acidophilus was a different one, since bacterial counts of this strain always decreased constantly, although this phenomenon sometimes did not occur before reaching the best of date. The attribution to different bacteria to corresponding dot plots was, however, merely presumptive. The vitality of preparations containing E. coli in monoculture could be demonstrated readily. As previously established for the pure cultures, loss of vitality was linked to decreasing bacterial counts. Using OSV, a minimum of 8.2 lg cfu/ml was detected by the best of date. Vitality of the bacteria dot plots could be asserted in the powdery product containing mixed cultures of lactobacilli, bifidobacteria, and lactococci via FACS, but a direct attribution to the different strains was as presumptive as seen already with the flavoured milk products. When establishing a limit of detection, the bacterial counts determined by OSV decreased in parallel to the dilution by approx. 1 lg cfu/ml while data obtained via FACS showed that after taking a similar course, the bacterial counts remained static at approx. 105cfu/ml. Thus, the limit of detection of bacterial counts via FACS amounts to 105cfu/ml. Bacterial counts of pure cultures with milk additive initially were the same in FACS and OSV. However, significant higher bacterial counts during storage were detected via FACS than were with OSV. Samples with milk additive yielded significantly more bacteria than samples without milk additive did in most cases. Applying both methods to flavoured milk products containing monocultures, no significant differences occurred. Regarding flavoured milk with mixed cultures however, precise differentiation and attribution of dot plots to the different strains were merely presumptive, similar to the situation encountered during vitality analysis. The data suggests that flow cytometry is suitable for qualitative analysis and quantification of pure cultures. The limit of detection established - 105cfu/g – ranges well below the recommended minimum content of probiotic bacteria (106cfu/g) implying therefore that flow cytometry may be used for quantitative analysis of probiotic products. The level of the detection limit corresponds with the results stated in the literature. Some higher bacterial counts were measured via FACS during storage. This may be due to the presence of viable bacteria that however were incapable of reproduction. These can be quantified by FACS but would elude conventional cultivation at the same time. So far, quality inspections were performed using culture methods that may be unable to detect all vital, stressed bacteria by growth, especially after storing. Using flow cytometry as an alternative would permit a simultaneous measurement of the amount and the vitality of bacteria in probiotic products. It appeared that milk had a protective effect on the product stability during storage. However, it was seen that the increased amounts of fat in milk hampered the measurement by FACS. Lower fat contents which are typical for most probiotic products however were revealed good results. While analysing milk products that contained many different cultures, overlapping dot plots made a reliable attribution of dot plots to the corresponding strains via FACS impossible. To cope with this, special markers, e.g. antibodies, gene probes or applying a sorting function while performing FACS measurement could improve this drawback. Flow cytometry, with a detection limit of 105cfu/g, seems also a suitable method to determine bacterial counts and vitality in pure cultures and monocultures. Additionally, living (yet non-reproducing) bacteria may be detected that still possess probiotic properties. Concerning milk products that contain mixed cultures however, additional techniques to identify the species should be integrated into the FACS analysis, where necessary.

Probiotische Produkte erfreuen sich weltweit zunehmender Beliebtheit. Mikroorganismen, die eine gesundheitsbezogene Wirkungskomponente besitzen, stellen hierbei den wertbestimmenden Anteil dar und sind von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Als Voraussetzung für einen physiologischen probiotischen Effekt gilt ein Gehalt von 106KbE/g Produkt. Die Keimzahlbestimmung probiotischer Bakterien aus Milchprodukten erfolgt bisher kulturell auf Elektiv- und/oder Selektivnährböden. Es existiert aber bislang keine Standardmethode. Da die kulturelle Methode außerdem zeitaufwendig ist, sind Schnellmethoden zur quantitativen Bestimmung wünschenswert. In diese Arbeit wurden daher 10 Stämme der Gattung Lactobacillus (L.), 7 der Gattung Bifidobacterium (B.), ein Stamm der Spezies Escherichia (E.) coli sowie Kulturen aus 10 Milchmischerzeugnissen und 3 pharmazeutischen Präparaten (zwei Monokulturen mit E. coli, eine Mischkultur mit L. paracasei, L. acidophilus, Bifidobacterium spp., Lactococcus lactis) einbezogen. Reinkulturen wurden entweder in Bouillon pur oder in Bouillon mit 25 % Milch (0,3 % und 3,5 % Fett) eingemischt und ebenso wie ein Teil der Milcherzeugnisse bei 4 °C für 42 Tage gelagert und an Tag 1, Tag 21 und Tag 42 untersucht. Die Pharmazeutika wurden 5 mal im monatlichen Intervall untersucht. Die Untersuchungen fanden parallel im Durchflusszytometer (FACSCalibur®, Becton Dickin-son) mithilfe der Fluoreszenzfarbstoffe SYTO®9 (Lebend- und Totfarbstoff), TO-PRO®-3 und PJ (Totfarbstoffe) sowie mittels Oberflächenspatelverfahren (OSV) auf verschiedenen Elektiv- bzw. Selektivnährböden (MRS, MRS-V, MUP, X-Glu, RCM, M-17, PC) statt. Zur Quantifizierung erfolgte im FACS die Zugabe einer bekannten Anzahl Beads (PeakFlow™ Orange flow cytometry reference beads 2,5 µm, 1,2 x 108) in bekanntem Volumen, wodurch rechnerisch der Gehalt der untersuchten Bakterien ermittelt werden konnte. Im Laufe der 42tägigen Lagerung wurde die bakterielle Vitalität von Reinkulturen und Produkten mit dem Durchflusszytometer bestimmt und mit den Änderungen der Keimzahlen des kulturellen Verfahrens verglichen. Die Fluoreszenzfarbstoffe ermöglichten die Unterscheidung von vitalen und toten Bakterien sowie eine prozentuale Bestimmung dieser Parameter. Danach wurde die Quantifizierung im FACS mithilfe von Beads (Dreifachansatz) etabliert. Zur Festlegung der Nachweisgrenze erfolgten Untersuchungen von Reinkulturen und einem Produkt mit Monokultur. Während des 42tägigen Lagerungsversuches wurde eine Keimzahlbestimmung von Reinkulturen mit und ohne Milchzusatz sowie Milchmischerzeugnissen durchgeführt. Die gewonnenen Werte wurden stets mit den mittels OSV (Doppelansatz) ermittelten Keimzahlen verglichen. Bei der Untersuchung der 12 Reinkulturen nahm die mittels OSV bestimmte Keimzahl ab, während parallel der Anteil toter Bakterien im FACS zunahm. 9 Stämme wie z.B. L. casei (S - 16) und B. animalis (S-4) zeigten relativ gleichbleibende Anteile bzw. eine geringe Abnahme vitaler Bakterien und Keimzahlen (Abnahme vitaler Bakterien 2,7-23 %, |∆ KZ| = 0,02-1,51 lg KbE/ml). 3 Stämme wie z.B. L. johnsonii (S-14) und B. longum (S-7) zeigten einen sehr großen Vitalitäts- und Keimzahlverlust (Abnahme vitaler Bakterien 67,3-79,7%, |∆ KZ| = 3,68-8,08 lg KbE/ml). Bei der Untersuchung der Milchmischprodukte konnte im OSV gezeigt werden, dass die im Produkt eingesetzten Stämme von L. casei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium sp. und S. thermophilus während der Lagerung sehr stabil blieben (|∆ KZ| ≤ 0,7 lg KbE/ml). Anders verhielt sich L. acidophilus, welcher stets eine große Abnahme der Keimzahl aufwies, wenn auch teilweise erst nach Ablauf des MHD. Im FACS war eine Zuordnung der Bakterienwolken nur präsumtiv möglich. Die Vitalität für Präparate mit Monokultur von E. coli ließ sich gut darstellen. Wie für die Reinkulturen ermittelt zeigte sich parallel zum Vitalitätsverlust eine Abnahme der Keimzahlen. Am MHD ließen sich im OSV mindestens 8,2 lg KbE/ml nachweisen. Im pulverförmigen Produkt mit einer Mischkultur von Laktobazillen, Bifidobakterien und Laktokokken ließ sich zwar im FACS die Vitalität der Bakterienwolken ermitteln, allerdings konnte wie bei den Milcherzeugnissen nur eine präsumtive Zuordnung zu den eingesetzten Stämmen erfolgen. Bei der Ermittlung der Nachweisgrenze nahmen die mittels OSV bestimmten Keimzahlen parallel zu den Verdünnungsstufen ca. 1 lg KbE/ml ab, während die im FACS gewonnenen Keimzahlen nach anfangs gleicher Entwicklung bei etwa 105KbE/ml stagnierten. Somit betrug die Nachweisgrenze der Keimzahlbestimmung im FACS 105KbE/ml. Die Keimzahlen für Reinkulturen mit Milchzusatz wiesen im FACS und OSV anfangs gleiche Keimgehalte auf. Allerdings waren im Laufe der 42tägigen Lagerung im FACS teilweise signifikant höhere Keimzahlen messbar als im OSV. In den Proben mit Milchzusatz waren häufig signifikant höhere Keimzahlen messbar als ohne Milchzusatz. Milchmischerzeugnisse mit Monokulturen lieferten mittels beider Methoden vergleichbare Ergebnisse, während sich wie schon bei der Vitalitätsbestimmung festgestellt die Zuordnung und Abgrenzung der Bakterienwolken für Mischkulturen im FACS nur präsumtiv vornehmen ließ. Für Messungen von Reinkulturen sowohl zur Qualifizierung als auch zur Quantifizierung erwies sich das Durchflusszytometer als geeignet. Die Nachweisgrenze von ca. 105KbE/g lag unter dem geforderten Mindestgehalt probiotischer Bakterien von 106KbE/g, so dass das Durchflusszytometer für quantitative Bestimmungen von probiotischen Produkten geeignet erschien. Die Höhe der Nachweisgrenze stimmte mit den Erkenntnissen anderer Arbeiten überein. Im Lagerungsverlauf wurden im FACS teilweise höhere Werte als im OSV bestimmt. Ursächlich könnten im Durchflusszytometer quantifizierbare, lebende, wenn auch nicht mehr vermehrungsfähiger Bakterien sein, die mit dem kulturellen Verfahren nicht mehr nachweisbar waren. Qualitätskontrollen wurden bisher mittels kultureller Verfahren durchgeführt und können – gerade nach Lagerung - nicht sicher alle vitalen, gestressten Bakterien durch Wachstum erfassen. Der alternative Einsatz eines Durchflusszytometers würde die gleichzeitige Erfassung von Vitalität und Keimzahl der Bakterien innerhalb kurzer Zeit erlauben. Milch schien einen protektiven Effekt auf die Lagerungsstabilität zu haben. Allerdings konnte gezeigt werden, dass bei Milchzusatz höhere Fettgehalte die Auswertung am FACS erschwerten, während bei einem mäßigen Fettanteil – wie bei der Mehrzahl probiotischer Produkte gegeben -  gute Ergebnisse zu erzielen waren. Bei der Untersuchung von Milchprodukten mit Mischkulturen verhinderten überlappende Bakterienwolken eine sichere Zuordnung der im FACS gemessenen Bakterien. Hier wären für eine Zuordnung der Bakterien spezielle Marker wie z.B. Antikörper und Gensonden oder der Einsatz der Sortierfunktion am FACS wünschenswert. Zur Vitalitäts- und Keimzahlbestimmung von Bakterien aus Rein- und Monokulturen scheint die Durchflusszytometrie mit einer Nachweisgrenze von ca. 105KbE/g geeignet. Im FACS lassen sich zusätzlich vitale, obgleich nicht mehr vermehrungsfähige Bakterien darstellen, die durchaus noch probiotisch wirksam sein könnten. Bei einer weiteren Produktgruppe, den Milchprodukten mit Mischkulturen, sind gegebenenfalls zusätzlich Techniken zur Speziesidentifizierung im FACS erforderlich.

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Ahlfeld, Birte: Durchflusszytometrische Bestimmungen von probiotischen Starterkulturen unter besonderer Berücksichtigung von Laktobazillen und Bifidobakterien. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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