Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung eines Screening-Verfahrens zur Wirksamkeitsprüfung von Multi-Enzymprodukten an pankreasgangligierten, ileocaecal fistulierten Miniaturschweinen

Claßen, Jessamyn

The efficacy of porcine enzyme products normally used in therapy of exocrine pancreatic insufficiency (EPI) is often unsatisfactory with regard to the digestion of fat.  Possible reasons for this include the relatively fixed protease-lipase-amylase-ratio as well as the high sensitivity of the lipase for acidic and proteolytic inactivation. Therefore, enzyme products of microbial origin, with a freely-selectable ratio of the different enzyme types, are in the focus of the current enzyme product development. Interactions between the enzymes (i.e. their compatibility), which may influence therapeutic efficacy, need to be studied in-vivo as early as possible. One-day screening tests – like those already successfully developed for mono-enzyme products (BECKER 2005; ZANTZ 2006) – allow a first comparative investigation to be made quickly and require minimal amounts of enzymes. The aim of the present study was to develop a screening test for multi-enzyme products (MEP). Two multi-enzyme preparations of different origin (MEP1: pancreatic/porcine; MEP2: microbial) were then tested in the screening test and the efficacy of one compared with that seen in a standard ileal digestibility trial, in both cases using pigs fed the diet developed for the screening-test. The efficacy of the two enzyme products on praecaecal and total digestibility was further compared in a standard digestibility trial, in pigs fed a human-like diet (i.e. its composition was orientated on diets of man). In all the studies, established methods were used for collection, processing and analysis of the samples. The studies were performed in 22 female Göttingen Minipigs fitted with an ileo-caecal-reentrant fistula. Pancreatic exocrine insufficiency was additionally induced by surgical ligation of the Ductus pancreaticus accessorius in 14 of these pigs (PL). The remaining 8 pigs were used as controls (KT). Per meal the animals got the following amounts of nutrients (g): screening diet: DM: 340; cp: 50.1; cfa: 59.9; st: 126; human-like diet: DM: 238; cp: 34.8; cfa: 74.4; st: 85.1. Cr2O3 (0.625 g) was added to each test meal as marker. In the screening test the screening diet was fed only once, in the morning of each screening day, after the pigs had been given 400 ml of the Provide-Xtra-Drink® (Fresenius Kabi, Bad Homburg) as evening meal 12 h before the screening test, as previously used in the lipase screening test (ZANTZ 2006).  In the standard digestibility trials animals were fed twice daily with the human-like diet (at 7 a.m. and 7 p.m.). MEP1 and MEP2 were added in the following dosages (U lipolytic activity/meal): Screening tests: PL- 0-phase without enzymes; MEP1/MEP2: D 1 (2.500), D 3 (20.000), D 5 (75.000); lipase-protease-amylase-ratio in MEP1 was 1:0.07:1.0, in MEP2 1:0,07:0,93. Standard ileal digestibility trials with the screening diet: MEP1 D5. Higher doses of both products were used in the studies with the human-like diet. Since MEP2 had proven to be less effective on fat digestion than MEP1 in the screening tests, it was used at higher lipase dosages than MEP1 to try to obtain comparable effects: PL-0-phase; MEP1: D 4 (27.000), D 6 (109.000), D 8 (326.000); lipase-protease-amylase-ratio: 1:0.07:1.03; MEP2: D 7 (140.000), D 9 (560.000), D 10 (1.680.000); lipase-protease-amylase-ratio: 1:0.003:0.046. Parameters surveyed were the amounts of nutrients (g) which reached the terminal ileum or were excreted with the faeces as well as the calculated nutrient disappearance rates (VR) and digestibilities (VQ). In the screening tests all parameters were significantly different between control animals and in the PL-0-phase. The addition of MEP1 and MEP2 caused a dose-dependent reduction of the amounts of nutrients reaching the terminal ileum and an increase of the VR. With dosage D5 of MEP1 the digestibilities were equivalent to those of the KT (except cfa-VR). Administration of MEP2 caused similar DM- and st-VR as well as cp-VR and cp-amounts reaching the terminal ileum in PL pigs as observed with the KT. The following observations are worth special mention: - the cp-VR after addition of MEP1 D5 almost corresponded to the cp-VR of the KT (MEP1 D5: 70%; KT: 72.0%); after use of MEP2 D5 a VR of only 55.9% was obtained; - the cfa-VR could be considerably increased by application of MEP1 D5 in comparison with the PL-0-phase (MEP1 D5: 74.2 %; PL-0-phase: 28.7%); with application of MEP2 D5 the cfa-VR was at least twice as high (50.6%) as in the PL-0-phase; - the st-VR achieved in the PL-0-phase already reached a high level (72.2%). Correspondingly, the standard of the KT could be obtained by addition of either enzyme product. Significant differences between the PL-0-phase and KT were also observed when the screening test diet was used in the standard ileal digestibility trial. Furthermore, as in the screening tests the administration of MEP1 D5 led to a distinct improvement in the digestibility of all nutrients, although the level of the KT was only reached for the amount of starch reaching the terminal ileum and the praecaecal st-VQ. In the standard digestibility trials with the “human-like diet” (praecaecal and total digestibility) the results of KT and PL-0-phase were significantly different. In addition, a dose- dependent reduction in the amount of nutrients reaching the terminal ileum or excreted with the faeces as well as a corresponding increase of the nutrient VQ (praecaecal and total) were observed with both MEP1 and MEP2. Administration of MEP1 improved praecaecal cp-VQ and faecal cp- and cfa-excretion to the level of the KT, while MEP2 achieved this for cp- and cfa-excretion with the faeces and the cp-VQ (over the complete digestive tract). Both MEP1 and MEP2 increased praecaecal st-VQ to the level of the KT (there was no significant difference between KT and PL-0-phase regarding total st-digestibility). Overall, in the screening tests with the screening test diet as well as for fat digestion in the standard digestibility trials with the human-like diet it could be seen that MEP1 was superior to MEP2. Regarding protease and amylase lower doses cause similar effects. In the latter test, similar results were achieved with the two products but much higher lipase doses of MEP2 were required. The administration of MEP1 and MEP2 led to a therapeutically relevant increase in the cfa-VQ (MEP1 D8: praecaecal 76.7%, total: 81.7%; MEP2 D10: praecaecal 81.0%, total: 84.3%). Conclusions: The newly developed screening test allows comparative investigation of the efficacy of multi-enzyme products. The differences observed in this test (i.e. ranking of the products regarding their effects on the digestibility of the different nutrients) can also be expected to be observed in classical digestibility studies, although differences may then be smaller. Regarding the lipase the comparative assessment of the efficacy of the two products tested (MEP1 and MEP2) was similar with both diets. In the screening-tests (same doses) protease efficacy of MEP1 was superior to MEP2, in the classical digestibility studies with the human-like diet (lower doses of MEP1) protease efficacy of MEP2 was superior to MEP1. Amylase could be argued either way. A diet- independent but strongly dose- dependent effect of the two multi-enzyme products was observed. It is therefore postulated that the results should be transferable to the situation in EPI patients.

Die Wirksamkeit der üblicherweise bei einer exokrinen Pankreasinsuffizienz (EPI) eingesetzten porcinen Enzymprodukte ist hinsichtlich der Fettverdauung oft nicht befriedigend. Als mögliche Ursachen werden das fixe Protease-Lipase-Amylase-Verhältnis sowie die hohe Empfindlichkeit der Lipase für eine saure und/oder proteolytische Inaktivierung diskutiert. Im Fokus der Produktentwicklung stehen daher Enzymprodukte mikrobieller Herkunft mit einer höheren Säuretoleranz und einem frei wählbaren Verhältnis der verschiedenen Enzymtypen. Eintägige Screening-Verfahren - wie für Mono-Enzymprodukte bereits entwickelt (BECKER 2005; ZANTZ 2006) - ermöglichen eine erste Einschätzung der Effizienz bei Einsatz geringster Enzymmengen. Aber auch mögliche Interaktionen zwischen den Enzymen, welche die Effizienz beeinflussen, sollten hierbei möglichst früh in-vivo geprüft und erkannt werden.  Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Schnelltests für Multi-Enzymprodukte (MEP) sowie die vergleichende Prüfung der Wirksamkeit zweier Produkte unterschiedlicher Herkunft (MEP1: porcin; MEP2: mikrobiell). Die für den Schnelltest entwickelte Diät wurde zusätzlich auch im klassischen Verfahren bezüglich der praecaecalen Verdaulichkeit überprüft. Des Weiteren interessierte die Wirksamkeit (praecaecal / gesamter Verdauungstrakt) der beiden Enzymprodukte bei Einsatz einer Diät, die sich hinsichtlich ihrer Zusammensetzung an der Ernährung des Menschen orientierte („Humandiät“). Probenkollektion, -aufbereitung und –analyse in den verschiedenen Versuchen erfolgten mittels etablierter Verfahren. Zum Einsatz kamen 22 weibliche Göttinger Miniaturschweine mit ileocaecaler Umleitungskanüle. Bei 14 Tieren (PL) wurde durch chirurgische Ligatur des Ductus pancreaticus accessorius experimentell eine EPI induziert, 8 Tiere bildeten die pankreasintakte Kontrollgruppe (KT). Von der Kombi-Testmahlzeit erhielten die Tiere pro Mahlzeit (g) 340 TS, 50,1 Rp, 59,9 Rfe und 126 Stärke, von der Humandiät 238 TS, 34,8 Rp, 74,4 Rfe und 85,1 Stärke. Beiden Diäten wurde pro Mahlzeit 0,625 g Chromoxid zugesetzt. Die Kombi-Testmahlzeit wurde einmalig am Morgen des Versuchstags appliziert, in den klassischen Verdaulichkeitsstudien wurde um 7 und 19Uhr gefüttert. Wie im Screening-Test für Lipasen (ZANTZ 2006) wurde am Vorabend des Multi-Enzym-Schnelltests das übliche Futter durch 400ml Provide-Xtra-Drink® ersetzt. MEP1 und MEP2 wurden in den Schnelltests in folgenden Dosierungen (U lipolytischer Aktivität/Mahlzeit) zugelegt: PL-0-Phase ohne Zulage, D1 (2.500), D3 (20.000) und D5 (75.000). Das Lipase-Protease-Amylase-Verhältnis betrug 1:0,07:1,03. In den klassischen praecaecalen Verdaulichkeits-Studien mit der Kombi-Testmahlzeit wurde  MEP1 in der Dosierung D5 verwendet. In den Versuchen mit der Humandiät wurden beide Produkte in noch höheren Dosierungen eingesetzt. Da sich MEP2 im Screening-Test bei Einsatz identischer Dosierungen lipolytischer Aktivität als weniger wirksam erwies, wurde dieses Produkt - um vergleichbare Effekte zu erzielen - höher dosiert als MEP1. Neben einer PL-0-Phase ohne Zulage erfolgte der Einsatz von MEP1 in den Dosierungen D4 (28.000), D6 (112.000) und D8 (336.000). Das Lipase-Protease-Amylase-Verhältnis entsprach jenem der Schnelltests. MEP2 wurde in den Dosierungen D7 (140.000), D9 (560.000) und  D10 (1.680.000) verwendet, das Lipase-Protease-Amylase-Verhältnis betrug 1:0,003:0,046. Entscheidende Parameter waren die im Kollektionszeitraum am terminalen Ileum angefluteten bzw. mit dem Kot ausgeschiedenen Nährstoffmengen (g) sowie die kalkulierten Nährstoff-Verschwindensraten (VR) bzw. –verdaulichkeiten (VQ). Ergebnisse: Im Screening-Test unterschieden sich die bei Kontrolltieren und in der PL-0-Phase ermittelten Werte hinsichtlich aller Parameter signifikant. Die Zulage von MEP1 und MEP2 führte dosisabhängig zu einer Reduktion der Nährstoffanflutung am terminalen Ileum bzw. einer Steigerung der VR. Mit Zulage von MEP1 D5 wurde Verdaulichkeiten wie bei den KT erreicht (Ausnahme: Rfe-VR). Nach Einsatz von MEP2 entsprachen die TS- und Stärke-VR sowie die Rp-Anflutung und –VR jener der KT. Folgende Beobachtungen verdienen besondere Erwähnung: - die Rp-VR im praecaecalen Bereich bei Zulage von MEP1 D5 entsprach mit 70% nahezu jener der KT (72,0%); mit MEP2 D5 wurde lediglich eine VR von 55,9% erzielt, - die Rfe-VR konnte durch Zulage beider Produkte im Vergleich zur PL-0-Phase deutlich gesteigert werden (PL-0-Phase: 28,7%; MEP2 D5: 50,6%; MEP1 D5: 74,2%), -  in Bezug auf die Stärke-VR wurde bereits in der PL-0-Phase ein relativ hohes Niveau erreicht (72,2%). Mit Zulage beider Produkte konnte das Niveau der KT erreicht werden. Wurde die für den Schnelltest entwickelte Diät im klassischen Verfahren auf die praecaecale Verdaulichkeit geprüft, so zeigten sich – wie in den Schnelltests - signifikante Unterschiede zwischen KT und PL-0-Phase. Die Zulage von MEP1 in der Dosierung D5 führte im Vergleich zur PL-0-Phase zu deutlich höheren praecaecalen Verdaulichkeiten der Nährstoffe, das Niveau der KT wurde allerdings nur im Hinblick auf die Anflutung und VQ von Stärke erreicht. Wurde die „Humandiät“ mit den beiden Enzymprodukten ergänzt, so unterschieden sich – sowohl praecaecal als auch über den gesamten Verdauungstrakt – die Ergebnisse von KT und PL-0-Phase signifikant. Eine dosisabhängige Reduktion der am terminalen Ileum angefluteten bzw. mit dem Kot ausgeschiedenen Nährstoffmengen sowie eine entsprechende Steigerung der Nährstoff-VQ (praecaecal und gesamt) wurden ebenfalls beobachtet. Obschon MEP1 bezüglich der lipolytischen Aktivitäten niedriger dosiert zum Einsatz kam als MEP2, wurde mit beiden Produkten eine ähnliche – therapeutisch relevante – Steigerung der Fettverdaulichkeit erzielt (MEP1 D8: praecaecal 76,7%, gesamt 81,7%; MEP2 D10: praecaecal 81,0%, gesamt 84,3%). Das Produkt MEP1 erwies sich diesbezüglich somit auch in den Studien mit der Humandiät als das wirksamere der beiden Produkte. Schlussfolgerungen: Die vergleichende Prüfung von Multi-Enzymprodukten hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf die praecaecale Verdaulichkeit ist im Screening-Test mittels einmaliger Applikation der neu entwickelten Diät möglich. Hierbei auftretende Unterschiede zwischen den Produkten (Rangierung der Produkte hinsichtlich ihrer Effekte auf die Verdaulichkeit der verschiedenen Nährstoffe) sind auch in klassischen Studien zu erwarten, allerdings auf einem insgesamt niedrigeren Niveau. Die Effizienz beider geprüften Produkte änderte sich auch nicht, wenn die „Humandiät“ zum Einsatz kam, d. h. es wurde eine diätunabhängige, aber stark dosisabhängige Wirkung der beiden Multi-Enzymprodukte beobachtet. Eine Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Anwendung bei EPI-Patienten ist somit zu postulieren. Bei Einsatz einer identischen Menge lipolytischer Einheiten war das porcine Produkt dem mikrobiellen hinsichtlich des Effektes auf die Fettverdaulichkeit zwar  überlegen, doch waren die zuzulegenden Substanzmengen des mikrobiellen Produktes dafür deutlich geringer. Effekte therapeutischer Relevanz ließen sich auch mit dem mikrobiellen Produkt erzielen, das mikrobielle Produkt bietet des Weiteren den bedeutenden Vorteil eines frei wählbaren Lipase-Protease-Amylase-Verhältnisses.

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Claßen, Jessamyn: Entwicklung eines Screening-Verfahrens zur Wirksamkeitsprüfung von Multi-Enzymprodukten an pankreasgangligierten, ileocaecal fistulierten Miniaturschweinen. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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