Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Kryokonservierbarkeit von Bullensperma unter besonderer Berücksichtigung des Verdünnungsgrades und des Seminalplasmas

Fischer, Alice

The aim of this study was to investigate the effects of an increasing sperm dilution and of seminal plasma on sperm quality parameters from cryopreserved bull spermatozoa. For this purpose, three different studies were undertaken. In the first study from a total of 42 bulls four repeated ejaculates were taken and processed to obtain three different dilution levels, which contained 60, 30 or 15 Mio. sperm/ml. By using flow cytometry the percentages of spermatozoa with intact plasma membrane (PMI), and those with a positive acrosomal state (PAS) were detected by FITC-PNA/PI-Assay. Furthermore the percentages of spermatozoa with elevated levels of disturbances in the chromatin structure (DFI%) and the heterogeneity of the DNA-integrity from the entire sperm population (SD-DFI) were tested by using the SCSA™. In the second study five ejaculates from each of three bulls were taken. Each ejaculate was diluted to 60 Mio. spermatozoa/ml and prior to cryopreservation homologous seminal plasma was added to the assays in concentrations of 0, 1, 3, 6 and 12%. After thawing PMI, PAS with and without the induction of the acrosome reaction by calciumionophore A 23187 (IPAS) as well as DFI% and SD-DFI were evaluated by flow cytometry. In the third study four seminal plasma samples from a total of nine bulls were separated by two-dimensional gel electrophoresis and the protein content from different protein spots was measured. The last mentioned parameters were compared to PMI, PAS, total antioxidative capacity (TAC) and concentration of superoxiddismutase (SOD) in the seminal plasma. The results of the present study indicate that increasing dilution of ejaculates had different effects on sperm quality parameters prior to and after cryopreservation. Prior to cryopreservation the values for PMI in lower sperm concentrations was slightly, but significantly (p < 0,01) higher than in concentrations that contained more spermatozoa. The percentages of PAS decreased with increasing dilution (p < 0,001). In contrast to these results the PMI-values decreased with increasing dilution after cryopreservation and the spermatozoa with PAS were not influenced by dilution level after cryopreservation (p > 0,05). There was a decline in DFI% and SD-DFI with increasing dilution of the ejaculate. The variability of PMI and PAS were higher between ejaculates than between individuals and this effect was observed as prior to as well as after cryopreservation. For these two parameters the individual-related effects increased marginal after cryopreservation compared to the ejaculate-related effects. With increasing dilution the individual-related effects increased in regard of PMI and PAS, too, but they were still lower than the ejaculate-related effects. The addition of seminal plasma had, similar to the increasing dilution, different effects on sperm quality. Whereas PMI and PAS were not influenced by seminal plasma, IPAS increased with increasing seminal plasma content (p < 0,05). The values for SD-DFI, but not DFI% were elevated in samples with high seminal plasma levels (p < 0,05). In each of the 36 seminal plasma samples 32 protein spots were obtained by two-dimensional gel-electrophoresis and were used for further analyses. The variability of the proteins in the seminal plasma was, except for one spot, higher between ejaculates than between individuals. Between the standardized volume of two protein spots (19, 22) and PMI two fair positive correlations (r = 0,54; p < 0,001 respectively r = 0,59; p < 0,001) occurred. Another fair positive correlation was found between TAC and protein spot 7 (r = 0,50; p < 0,01). In conclusion, dilution of spermatozoa and addition of seminal plasma had different effects on sperm quality parameters. Furthermore, there might be positive effects of certain seminal plasma proteins on sperm quality. Finally, the variabilities of sperm quality and of the composition of the seminal plasma depends more on variations between ejaculates than on differences between animals.

Das Ziel dieser Arbeit war, zu überprüfen, welche Auswirkungen der Verdünnungsgrad des Spermas und das Seminalplasma auf die Spermaqualität kryokonservierten Bullenspermas haben. Hierfür wurden drei verschiedene Versuchsansätze durchgeführt. Im ersten Versuch wurden von 42 Bullen je vier Ejakulate gewonnen und diese in drei verschiedenen Verdünnungen aufbereitet, welche 60, 30 und 15 Mio. Spermien/ml umfassten. Durchflusszytometrisch wurden die Anteile plasmamembranintakter Spermien (PMI) sowie der Spermien mit positivem akrosomalen Status (PAS) mittels des FITC-PNA/PI-Assays erfasst. Ausserdem wurde mit Hilfe des SCSAÔ der prozentuale Anteil von Spermien mit erhöhten Veränderungen in der DNA-Integrität (DFI%) und die Heterogenität der DNA-Integrität in der gesamten Spermienpopulation (SD-DFI%) gestestet. Im zweiten Versuch wurden je fünf Ejakulate von drei Bullen gewonnen. Den Ejakulaten wurden nach der Verdünnung auf 60 Mio. Spermien/ml 0, 1, 3, 6 oder 12% homologes Seminalplasma zugefügt und die so hergestellten Pailletten dann kryokonserviert. Nach dem Auftauen wurden durchflusszytometrisch PMI, PAS mit und ohne Induktion der Akrosomenreaktion mittels Kalzium-Ionophor A 23187 (IPAS) sowie DFI% und SD-DFI ermittelt. Im dritten Versuch wurden von neun Bullen je vier Seminalplasmaproben mittels einer zweidimensionalen Gelelektrophorese aufgetrennt und die Proteingehalte der einzelnen Spots ermittelt. Diese wurden dann PMI, PAS, der totalen antioxidativen Kapazität (TAC) sowie der Konzentration an Superoxiddismutase (SOD) im Seminalplasma gegenübergestellt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass ein steigender Verdünnungsgrad der Ejakulate vor und nach der Kryokonservierung auf verschiedene Spermaqualitätsparameter unterschiedliche Effekte hat. Vor der Kryokonservierung waren die PMI-Werte bei niedrigen Spermakonzentrationen geringgradig, aber signifikant (p < 0,01) höher als bei höheren Konzentrationen. Die PAS-Werte waren dagegen mit steigendem Verdünnungsgrad abgefallen (p < 0,0001). Im Gegensatz dazu waren bei den kryokonservierten Proben mit steigendem Verdünnungsgrad die PMI-Werte abgefallen, während sich die PAS-Werte nicht (p > 0,05) geändert hatten. Die DFI%- und SD-DFI-Werte fielen mit steigendem Verdünnungsgrad ab. Die Variabilitäten von PMI und PAS waren sowohl vor, als auch nach der Kryokonservierung zwischen den Ejakulaten höher als zwischen den Bullen. Bei diesen Parametern war der tierindividuelle im Vergleich zum ejakulatbedingten Effekt nach im Vergleich zu vor der Kryokonservierung etwas angestiegen. Auch mit steigendem Verdünnungsgrad nahm der Einfluss des Bullen auf PMI und PAS geringfügig zu, die Werte waren aber immer noch niedriger als der Effekt des Ejakulates. Die Zugabe von Seminalplasma hatte ebenso wie der zunehmende Verdünnungsgrad unterschiedliche Auswirkungen auf die Qualität des Spermas. Während die PMI und PI sich nicht änderten, nahm mit zunehmendem Gehalt an Seminalplasma IPAS zu (p < 0,05). Die SD-DFI-Werte, aber nicht DFI% erhöhten sich mit steigendem Seminalplasmagehalt (p < 0,05). In jeder der 36 Seminalplasmaproben wurden 32 Proteinspots mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und für weitere Auswertungen herangezogen. Die Variabilität der Proteingehalte war, bis auf eine Ausnahme, zwischen den Ejakulaten höher als zwischen den Bullen. Zwischen den normierten Volumina zweier Proteinspots (19, 22) und PMI bestanden mittelgradige Korrelationen (r = 0,54; p < 0,001 bzw. r = 0,59; p < 0,001). Weiterhin korrelierten der Proteinspot 7 und TAC mittelgradig (r = 0,50; p < 0,01) miteinander. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass die Verdünnung des Spermas und die Zugabe von Seminalplasma unterschiedliche Effekte auf verschiedene Spermaqualitätsparameter haben. Ferner scheinen sich bestimmte Proteine im Seminalplasma positiv auf die Spermaqualität auszuwirken. Die Variabilität der Spermaqualität und die Zusammensetzung des Seminalplasmas ist dabei weniger auf Unterschiede zwischen den Tieren, als vielmehr auf Variationen zwischen den Ejakulaten zurückzuführen.

Quote

Citation style:

Fischer, Alice: Untersuchungen zur Kryokonservierbarkeit von Bullensperma unter besonderer Berücksichtigung des Verdünnungsgrades und des Seminalplasmas. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export