Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Investigations on the interactions between the concentrate proportion in the ration of dairy cows and the presence or absence of a Fusarium toxin-contaminated triticale on animal health, performnce and deoxynivalenol residues in serum, bile and milk

Keese, Christina

Deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZON) are toxic secondary metabolites of moulds (referred as to mycotoxins) of the genus Fusarium, which are particularly important in European husbandry due to their frequent occurrence in toxicologically relevant concentrations. Although ruminants appear to be relatively tolerant to DON because of the ability of the ruminal microorganisms to metabolize DON to the almost non-toxic de-epoxy DON (DOM-1), data about long-term effects of moderate DON concentrations on dairy cows are still lacking. Furthermore, unpublished reports about high contents of unmetabolised DON in the serum and milk of clinically affected cows bring up the question of whether disease-related alterations in the ruminal environment and/or in the ruminal epithelium could lead to an increased absorption of DON into blood and milk, which would be of particular importance not only with regard to animal health and performance, but also from a consumer protection point of view. As high concentrate proportions are fed to high-yielding dairy cows nowadays, subacute ruminal acidosis (SARA) has become a common problem in dairy herds, which is characterized by decreased ruminal pH values lower than 5.6, adaptive changes up to degenerative processes in the ruminal mucosa and changed ruminal fermentation conditions. Therefore, the aim of the present study was to investigate the effects of different concentrate proportions in the presence and absence of naturally infected Fusarium toxin-contaminated triticale on the health and performance of dairy cows and on the DON residues in serum, bile and milk in cows fed the experimental diets over a total period of 29 weeks. In Period 1, the acceptance and the effects of the Fusarium toxin-contaminated triticale, with DON the dominating mycotoxin, on animal health and performance were tested. Therefore, a total of 13 early lactating German Holstein cows (Myco Group) received a diet with 50% concentrate, 25% maize- and 25% grass silage (on dry matter [DM] basis) and 5.3 mg DON/kg DM on average as a total mixed ration (TMR) for ad libitum intake over 11 weeks, while another 14 German Holstein cows received the control diet. In Period 2, which followed directly after finishing Period 1 and lasted over 18 weeks, the same 27 cows, plus five additional cows (the latter after being fed the experimental diets for 8 weeks), were divided into four feeding groups to examine the effects of an elevated dietary concentrate proportion of 60% compared to a low concentrate level of 30%: Group Control-30, (30% concentrates), Myco-30 (30% concentrates, 4.4 mg DON/kg DM), Control-60 (60% concentrates) and Myco-60 (60% concentrates, 4.6 mg DON/kg DM). Cows fed the mycotoxin diets in Period 1 further received one of the mycotoxin diets in Period 2. After feeding the experimental rations over a total period of 29 weeks, a depletion period was conducted during which all cows received the control diet with 30% concentrates for another four weeks, and milk and serum samples were analysed for DON residues. DON and DOM-1 residues were determined in serum, bile and milk by HPLC with UV detection after incubation with β-glucuronidase. The overall performance level was characterized by an average daily dry matter intake (DMI) of 17.9 kg and an average daily milk production of 26.7 kg fat corrected milk (FCM) in Period 1, and 17.3 kg DMI and 24.5 kg FCM in Period 2, respectively. The occurring diseases could not be attributed to the experimental factors. In both periods, cows fed the Fusarium toxin-contaminated diets consumed more DM (in Period 2 only significant for Group Myco-30), which was probably caused by stimulating effects of the Fusarium-infected triticale on the ingesta passage rate. Elevating the concentrate proportion to 60% had a stimulating effect on the DMI in both Control- and Myco Group as well. These differences in DMI explained most of the observed effects on milk yield and –composition. In Period 1, cows fed the Fusarium toxin-contaminated diet produced significantly more milk, while the milk fat concentration, the milk protein concentration, the fat-to-protein-ratio (FPR) and the milk urea were lower compared to control cows. Mycotoxin-fed cows had a higher somatic cell count (SCC), but this result should be interpreted carefully, as this effect was not observed in Period 2. In Period 2, on a low concentrate level, FCM was significantly higher in the mycotoxin fed group. On a high concentrate level, milk yield was higher in Group Myco-60, but milk fat and protein concentration, FPR and milk urea were significantly lower. FCM was on a similar level. The depressing effect of a high concentrate proportion on milk fat was more pronounced in the presence of Fusarium toxin-contaminated triticale, and the milk fat synthesis was consistently, but not statistically, lower in Group Myco-60 than in the Control cows. This effect could just be a result from the higher milk production (dilution effect), but the presence of Fusarium infected and Fusarium toxin-contaminated triticale might have influenced the ruminal CLA synthesis under high concentrate proportions and might have contributed to the described effect on milk fat as well. Ruminal fluids were collected (using the Geishauser method), 1. to examine the occurrence of critical pH values indicating SARA and, 2.,to test the concentrate- and mycotoxin-related effects on the ruminal fermentation patterns. For technical reasons, ruminal fluids were collected after a period of feed restriction between 3 to 5 hours, and this period of fasting probably did overlap the critical values. However, significantly lower ruminal pH values were detected in Weeks 4 and 8 and lower minimum pH values critical for developing SARA occurred in the Myco-Group. Accordingly, the net acid base excretion (NABE) in the urine and the base-to-acid ratio (BAR) were lower (only significant in Week 8). These effects were probably caused by the higher DMI in this group and explained the observed changes in the ruminal fermentation patterns as well. In Period 2 the patterns of the SCFA were significantly influenced by an elevated concentrate proportion, whereas NABE and BAR did not reveal a distinct concentrate effect. The ruminal pH values were on a high level in all groups, and critical pH values were missed. Further alterations in the SCFA pattern were found in the presence of Fusarium toxin-contaminated triticale, which were possibly caused by indirect effects of the Fusarium infection-related alterations of the physico-chemical properties of the infected cereal on ruminal microbes. DOM-1 was the predominant residue found in significantly higher concentrations in serum, bile and milk of cows fed the Fusarium toxin contaminated diets in both periods. In serum, unmetabolised DON was detected in low concentrations (up to 4 ng/ml) in Period 1 and occurred only sporadically in Period 2 in the serum of mycotoxin fed cows. In the Myco Group, DOM-1 was found in the range of 22 up to 123 ng/ml in serum, up to 391 ng/ml in bile and between 0.6 and 2.2 μg/kg in fresh milk in Period 1. In Period 2, cows fed the low concentrate diets had significantly higher DOM-1 concentrations in serum and bile, and the carry over into milk (as the ratio between daily excretion of DOM-1 into milk and DON intake) was significantly higher in Group Myco-30 compared to Group Myco-60 (0.0002 and 0.001 (Myco-30) and 0.0001-0.0011 (Myco-60), respectively, in Period 2). Milk samples of control cows did not contain any measurable DON residues in either period. Independent of the concentrate proportion, unmetabolised DON was not detected in milk using the HPLC-UV method. With the more sensitive LC-MS/MS method, the parent toxin could only be detected in trace amounts (≤ 0.2 μg/kg fresh milk) in 2 out of 24 additionally analysed milk samples. With increased milk yields, the carry over tended to increase as well. In both periods the metabolite profile in the physiological substrates was unaffected by any dietary treatment. After feeding the control diet with 30% concentrate for one week to all cows directly after terminating the feeding of the contaminated diets (Myco-30 and -60), no measurable amounts of DON and DOM-1 were detectable in any milk samples. Accordingly, DOM-1 concentrations in serum were on the same low level as in control cows continuously fed the uncontaminated diets when samples were taken after 3 weeks of feeding the control ration, which implied that DON is rapidly excreted after exposure and does probably not accumulate in DON-fed cows. In conclusion the animal health and the performance of dairy cows was not negatively affected in cows fed rations with DON concentrations between 4.4 and 5.3 mg/kg DM, and concentrate proportions between 30 and 60%, over a total period of 29 weeks. No obvious clinical signs for SARA occurred, but there were hints for a higher acidotic burden in the Myco Group in Period 1 and in cows fed 60% concentrate in Period 2, which were more pronounced in the presence of Fusarium toxin probably due to complex effects of mycotoxins, fungus-related alterations of the physico-chemical properties of the contaminated triticale, modified ruminal microbial diversity and probably other factors. A high concentrate proportion of 60% did not affect the levels of DON and DOM-1 in serum, bile and milk in this experiment. No significant amounts of unmetabolised DON occurred in the serum, so that it can be concluded that the barrier function of the ruminal epithelium and/or the detoxification capacity of the rumen were not impaired under the described conditions in this trial. The carry over in milk can be regarded as negligible, but the trend to increased carry over rates with increased milk yields and the carry over in cows with a disturbed blood-udder-barrier should be examined further. The higher DOM-1 residues in cows fed 30% concentrate may result from an altered bioavailability of DON from maize silage and/or the presence of masked mycotoxins in the ration. Thus, the occurrence of masked mycotoxins in dairy cow rations and the bioavailability of DON dependent on the plant matrix should be evaluated in future research.

Den von Schimmelpilzen der Gattung Fusarium gebildeten Mykotoxinen Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZON) kommt in Europa die größte praktische Bedeutung zu, da sie in Konzentrationen vorkommen können, die für landwirtschaftliche Nutztiere bedeutsam sein können. Wiederkäuer gelten als relativ unempfindlich gegenüber DON durch die Fähigkeit ihrer Mikroorganismen im Pansen, DON zu dem fast ungiftigen Deepoxy-DON (DOM-1) zu metabolisieren. Allerdings gibt es bislang keine Studien über Langzeiteffekte moderater DON-Konzentrationen bei Milchkühen. Zudem werfen neuere unveröffentlichte Befunde über das Auftreten hoher, nicht metabolisierter DON-Konzentrationen in Serum und Milch klinisch auffälliger Kühe die Frage auf, ob es bei krankheitsbedingten Veränderungen im Pansenmilieu und/oder veränderten Absorptionsbedingungen an der Pansenschleimhaut zu einem Übergang von DON in die Milch kommen kann, was nicht nur im Hinblick auf Tiergesundheit und Leistung, sondern auch in Bezug auf den Verbraucherschutz von erheblicher Bedeutung wäre. Da heutzutage hohe Konzentratanteile in der Ration von Hochleistungskühen eingesetzt werden, ist die subakute Pansenazidose (SARA) zu einem gängigen Problem in Milchkuhherden geworden. Bei SARA kommt es zum Abfall des ruminalen pH-Wertes unterhalb 5.6, zu adaptiven bis hin zu degenerativen Prozessen an der Pansenschleimhaut sowie zu veränderten Fermentationsbedingungen im Pansen. Ziel der Arbeit war es daher, die Effekte von unterschiedlich hohen Konzentratanteilen sowohl in Anwesenheit wie auch in Abwesenheit von natürlich infizierter Fusarium-Toxin kontaminierten Triticale auf die Gesundheit und Leistung sowie auf DON-Rückstände in Serum, Galle und Milch von Milchkühen über einen längeren Versuchszeitraum von insgesamt 29 Wochen zu untersuchen. In Periode 1 wurden die Akzeptanz und die Effekte einer Fusarium-Toxin kontaminierten Triticale mit DON als hauptsächlichen Kontaminanten auf Tiergesundheit und Leistung getestet. Dazu erhielten 13 frühlaktierende Deutsche Holstein-Kühe (Myko-Gruppe) eine Ration mit durchschnittlich 5.3 mg DON und 0.1 mg ZON/kg Trockensubstanz (T) und einem Konzentratanteil von 50% und jeweils 25% Gras- und Maissilage (auf T-basis) als totale Mischration (TMR) zur ad libitum Aufnahme. 14 weitere Deutsche Holstein-Kühe erhielten die Kontrollration. In Periode 2, die direkt an Periode 1 anschloss und die über 18 Wochen durchgeführt wurde, wurden die gleichen 27 Kühe und 5 weitere Kühe (letztere nach entsprechender Anfütterung) in 4 Fütterungsgruppen unterteilt. In zwei Gruppen wurde der Konzentratanteil in der Ration auf 60% angehoben und die Effekte mit einem niedrigen Konzentratniveau von 30% verglichen. Dabei erhielten Kühe, die die DON-Rationen in Periode 1 erhalten hatten, eine der DON-kontaminierten Rationen in Periode 2. Daraus ergaben sich folgende Gruppen: Gruppe Kontrolle-30 (30% Konzentrat), Gruppe Myko-30 (30% Konzentrat, 4.4 mg DON/kg T in der Ration), Gruppe Kontrolle-60 (60% Konzentrat) und Gruppe Myko-60 (60% Konzentrat, 4.6 mg DON/kg T in der Ration). Anschließend folgte eine Abfütterungsphase, in der alle Kühe die Kontrollration mit 30% Konzentrat über vier Wochen erhielten und in der weitere Milch- und Serumproben genommen wurden. Die Bestimmung von DON und DOM-1-Rückständen in Serum, Galle und Milch erfolgte nach einer Inkubation mit β-Glucuronidase mit einer HPLC-UV-Methode. Das Leistungsniveau der Kühe war charakterisiert durch eine durchschnittliche tägliche T-Aufnahme von 17.9 kg and eine durchschnittliche tägliche Milchleistung von 26.7 kg fett-korrigierter Milch (FCM) in Periode 1 und 17.3 kg T und 24.5 kg FCM in Periode 2. Die während des Versuches auftretenden Erkrankungen ließen sich nicht auf die Behandlungsfaktoren zurückzuführen. In beiden Perioden zeigten die Tiere in den Gruppen mit Fusarium-Toxin Kontamination eine höhere T-aufnahme (in Periode 2 nur signifikant für Gruppe Myko-30), die vermutlich verursacht wurde durch die stimulierenden Effekte der Fusarium-Toxin kontaminierten Triticale auf die Ingesta-Passagerate. Auch ein erhöhter Konzentratanteil von 60% stimulierte die T-Aufnahme. Die meisten der beobachteten Effekte auf Milchleistung und –zusammen-setzung ließen sich auf die Unterschiede in der T-Aufnahme zurückführen. In Periode 1 war die Milchleistung in der Myko-Gruppe um ca. 11% höher, während die Fett-, und Proteinkonzentration in der Milch sowie das Fett:Protein-Verhältnis niedriger waren als bei den Kontrolltieren. Gleichzeitig war die somatische Zellzahl in der Milch der Myko-Gruppe erhöht. Da aber dieser Effekt nicht in Periode 2 auftrat, Aussagekraft dieses Ergebnisses fraglich. In Periode 2 war die FCM-Leistung der Gruppe Myko-30 signifikant höher als die der Gruppe Kontrolle-30. Bei den Hoch-Konzentrat-Gruppen war die Milchleistung bei den Mykotoxin-gefütterten Tieren signifikant höher als bei den Kontrolltieren, während Milchfett-, und Proteinkonzentration, das Fett:Protein-Verhältnis sowie der Milchharnstoff in der Gruppe Myco-60 niedriger waren. Der milchfettsenkende Effekt eines hohen Konzentratanteils war deutlicher in Anwesenheit von Fusarium-Toxin kontaminierten Triticale, und die Milchfettsyntheseleistung war bei Gruppe Myko-60 konstant, wenn auch nicht signifikant, niedriger als bei den Kontrolltieren. Der Effekt auf die Milchfettkonzentration ist daher wahrscheinlich auf die erhöhte Milchproduktion zurückzuführen, andererseits könnte aber die ruminale CLA-Synthese auch durch die Anwesenheit der Fusarium-geschädigten und Fusarium-Toxin kontaminierten Triticale beeinflusst gewesen sein. Pansensaftproben, entnommen mit dem Pansensaftentnahmegerät nach Geishauser, wurden untersucht um kritische Werte in Bezug auf SARA aufzudecken sowie konzentrat- und mykotoxinbedingte Effekte auf das ruminale Fermentationsmuster zu untersuchen. Da aus technischen Gründen die Pansensaftentnahme nach dem Melken nach einem 3 bis 5-stündigen Futterentzug stattfand, überlappte diese Fastenperiode wahrscheinlich kritische pH-Werte. Trotzdem traten in der Myko-Gruppe in Periode 1 signifikant niedrigere pH-Werte auf als bei Kontrollkühen, und die minimalen pH-Werte waren bei Einzeltieren unterhalb des Grenzbereiches von 5.9 bis 6.2, der als kritisch für die Entwicklung von SARA angesehen wird. Übereinstimmend dazu waren die Netto-Säure-Base-Bestimmung (NABE) und der Basen-Säuren-Quotient (BAR) niedriger als bei den Kontrolltieren. Diese Effekte sind wahrscheinlich auf die höhere T-Aufnahme in der Myko-Gruppe zurückzuführen und erklären auch die Unterschiede im Fermentationsmuster im Pansensaft. Ein erhöhter Konzentratanteil in Periode 2 beeinflusste das Fermentationsmuster im Pansensaft signifikant, wogegen die Bestimmung von NABE and BAR im Urin keinen deutlichen Konzentrateffekt aufzeigte. Die Pansen-pH-Werte waren in Periode 2 auf einem hohen Niveau und kritische pH-Werte traten nicht auf. In Anwesenheit von Fusarium-Toxin kontaminierten Triticale traten weitere signifikante Unterschiede im Fettsäuremuster im Pansensaft auf. Diese wurden vermutlich hervorgerufen durch indirekte Effekte auf die ruminale Mikroorganismen, welche induziert wurden durch die Veränderungen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Fusarium-infizierten Triticale. In Serum, Galle und Milch wurde während beider Perioden hauptsächlich DOM-1 nachgewiesen. Nicht-metabolisiertes DON trat im Serum nur in sehr niedrigen Konzentrationen (maximal 4 ng/ml) in Periode 1 und nur sporadisch in Periode 2 in Mykotoxin-gefütterten Kühen auf. In Periode 1 lagen die DOM-1 Konzentration in der Myko-Gruppe zwischen 22 und 123 ng/ml im Serum, bei unterhalb der Nachweisgrenze bis hin zu 391 ng/ml in der Galle und zwischen 0.6 und 2.2 μg/kg Frischmilch. In Periode 2 zeigte sich, dass Kühe in den Niedrigkonzentratgruppen signifikant höhere DOM-1 Gehalte in Serum und Galle hatten, sowie bei Gruppe Myko-30 eine höhere Carry-over Rate verglichen mit Gruppe Myko-60. Die Carry-over Raten (als Verhältnis zwischen der täglichen Ausscheidung von DOM-1 in die Milch und der DON-Aufnahme) lagen zwischen 0.0002 und 0.0006 in der Myko-Gruppe in Periode 1, zwischen 0.0002 und 0.001 in Gruppe Myko-30 und zwischen 0.0001-0.001 in Gruppe Myko-60 in Periode 2. In der Milch von Kontrollkühen konnten weder in Periode 1 noch in Periode 2 DON/DOM-1-Rückstände nachgewiesen werden. Unabhängig vom Konzentratanteil konnte mit der HPLC-UV-Methode kein nicht-metabolisiertes DON in den Milchproben nachgewiesen werden. Mit der sensitiveren LC-MS/MS-Methode konnte von 24 zusätzlich untersuchten Milchproben nur in 2 Proben Spuren (≤ 0.2 μg/kg Frischmilch) von nicht-metabolisiertem DON nachgewiesen werden. Es zeigte sich ein Trend zu einer höheren Carry-over Rate (gezeigt für DOM-1) bei höherer Milchleistung. Nach einwöchiger Fütterung der Kontroll-30-Ration an alle Kühe waren in den Milchproben keine DON-Rückstände mehr nachweisbar, und die DOM-1 Gehalte im Serum (untersucht nach 3 Wochen Abfütterung) waren auf ähnlich niedrigem Level wie in den Kontrolltieren. Dies lässt die Vermutung zu, dass DON-Rückstände nach der Exposition schnell ausgeschieden werden und sich vermutlich nicht im Tier ablagern. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass keine negativen Effekte auf Tiergesundheit und Leistung gefunden wurden, wenn Rationen mit DON-Gehalten zwischen 4.4 und 5.3 mg/kg T und Konzentratanteilen zwischen 30 und 60% über einen Gesamtzeitraum von 29 Wochen eingesetzt wurden. Die Kühe zeigten keine klinischen Anzeichen für das Vorliegen von SARA. Es gab jedoch Hinweise, die auf eine höhere azidotische Belastung in der Myko-Gruppe in Periode 1 und in den Hoch-Konzentrat-Gruppen in Periode 2, hier insbesondere in Anwesenheit von Fusarium-Toxin, schließen ließen, wahrscheinlich hervorgerufen durch die komplexen Effekte von Mykotoxinen, durch die Pilzinfektion bedingten Veränderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften der kontaminierten Triticale, Veränderungen in der ruminalen Mikrobengemeinschaft und weiteren unbekannten Faktoren. In dieser Arbeit hatte ein hoher Konzentratanteil keinen Einfluss auf die DON und DOM-1-Konzentrationen im Serum, Galle und Milch. Es waren keine relevanten Gehalte an nicht-metabolisierten DON im Serum nachweisbar, woraus gefolgert werden kann, dass die Barrierefunktion des Pansenepithels und/oder die Entgiftungsfunktion des Pansens unter den beschriebenen Fütterungsbedingungen vermutlich nicht beeinträchtigt war. Der Carry-over in Milch kann als geringfügig eingeschätzt werden, allerdings sollte der Carry-over bei hohen Milchleistungen sowie bei gestörter Blut-Euterschranke weiter untersucht werden. Die höheren DOM-1-Rückstände bei Kühen, die 30% Konzentrat erhielten, sind vermutlich auf eine höhere Bioverfügbarkeit von DON aus der Maissilage und/oder auf die Präsens von maskierten Mykotoxinen zurückzuführen. Daher sollte das Auftreten von maskierten Mykotoxinen und die Bioverfügbarkeit von DON in Abhängigkeit von der pflanzlichen Matrix in zukünftigen Studien untersucht werden. Außerdem sind weitere Studien nötig, die die Effekte praktisch relevanter DON-Konzentrationen bei klinisch gestörten Milchkühen und Mastbullen untersuchen.

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Keese, Christina: Investigations on the interactions between the concentrate proportion in the ration of dairy cows and the presence or absence of a Fusarium toxin-contaminated triticale on animal health, performnce and deoxynivalenol residues in serum, bile and milk. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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