Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Phylogenetische Charakterisierung von Campylobacter-Isolaten aus der Geflügelschlachtung

Langen, Marcus

Thermophylic Campylobacter spp. present one of the most important bacterial foodborne infection agents in Germany and Europe. To analyse phylogenetic relationship of Campylobacter-infections in poultry 382 Campylobacter-isolates were typed by means of Restrictions-Fragment-Length-Polymorphism (RFLP) using the enzymes Smal respectively Kpnl and totalgenomic DNA. The isolates originated from 12 slaughter-flocks from seven different farms in Northern-Germany and were collected in the years 2005 and 2006. They were stored at -80°C by using a microbank-system. In addition to the isolates from Germany 10 Campylobacter-isolates of hens from Italy and four reference strains were included in the study. The MLST-analysis was based on the sequencing of seven housekeeping-gene sections (aspartate A, glutamine synthetase, citrate synthase, serine hydroxymethyltransferase, phosphoglycomutase, transketolase, ATP synthase) which first had to be amplified using polymerase-chain-reaction (PCR). By using the online database PubMLST allele numbers were assigned to the housekeeping-gene sequences. Sequence types (STs) respectively clonal complexes (CC) were assigned to the isolates by means of their allelic profile. In addition an UPGMA-dendrogramm as well as a population model (minimum-spanning-tree) based on the allelic profile of the isolates typed by MLST was generated. Isolates within RFLP-clusters that were built with a cut-off value of ≥ 90 % similarity had identical STs. Therefore the isolates with a cut-off value ≥ 90 % similarity were merged into clusters flock-wise on the basis of their Smal restriction profile and at least one isolate per cluster was typed by means of Multilocus-Sequence-Typing (MLST). In that way 130 Campylobacter-isolates were analysed by MLST. In total 47 different STs were detected from which 17 STs appeared the first time within this study. Furthermore the allele glyA-303 was described the first time. For the isolates two till seven different STs were detected within the flocks. In comparison of the allele sequences of the housekeeping-genes some alleles stood out with a high rate of nucleotide substitutions. These alleles could be assigned to C. coli-isolates. In the UPGMA-dendrogram which was built on the basis of the allele profile it was obvious that identical STs appeared repeatedly in flocks from different farms. Within the minimum-spanning-tree two clearly separated groups could be distinguished. All the C. coli-isolates belonged to one group and all C. jejuni-isolates belonged to the other group. Only one clonal complex was detected in the group of C. coli-isolates to which 10 out of 15 STs belonged. The other five STs could not be assigned to a clonal complex (singletons). 15 STs were identified as singletons within the group of C. jejuni-isolates. The others were divided into seven clonal complexes. In comparison of the allele sequences as well as in the minimum-spanning-tree the higher genetic diversity of the C. jejuni-isolates compared to C. coli-isolates became clear. It could be demonstrated that different Campylobacter-genotypes appeared within one flock. By the UPGMA-dendrograms developed on the basis of allele profiles showed no farm specific Campylobacter-genotypes.

Thermophile Campylobacter spp. stellen deutschland- und europaweit eine der bedeutendsten bakteriell bedingten Lebensmittelinfektionserreger dar. Um phylogenetische Zusammenhänge zwischen Campylobacter spp. beim Mastgeflügel zu analysieren, wurden 382 Campylobacter-Isolate zunächst mittels Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen SmaI bzw. KpnI und gesamtgenomischer DNA typisiert. Die im Mikrobanksystem bei -80°C konservierten Isolate stammten aus 12 Schlachtherden von sieben norddeutschen Mastbetrieben und wurden in den Jahren 2005 und 2006 an einem norddeutschen Geflügel-Schlachthof gewonnen. Zusätzlich zu den Isolaten aus Deutschland wurden 10 Campylobacter-Isolate von Masthühnern aus Italien, sowie vier Referenzstämme in die Untersuchung mit einbezogen. Die MLST-Analyse basierte auf der Sequenzierung von sieben Housekeeping-Gen-Abschnitten (Aspartat Ammonium Lyase, Glutamin Synthetase, Citrat Synthase, Serin Hydroxymethyltransferase, Phosphoglycerat Mutase, Transketolase, ATP Synthase), welche zunächst mittels Polymerase-Chain-Reaction (PCR) amplifiziert wurden. Den jeweiligen Housekeeping-Gen-Sequenzen wurden über die Onlinedatenbank pubMLST Allelnummern und den Isolaten anhand ihres Allelmusters Sequenztypen und klonale Komplexe zugeordnet. Zusätzlich wurde ein UPGMA-Dendrogramm auf Basis der Allelmuster und ein Populationsmodell (Minimum-Spanning-Tree) der per MLST analysierten Isolate erstellt. Bei Isolaten, die sich innerhalb von RFLP-Clustern mit einem Cut-off Wert von ≥ 90 % Ähnlichkeit befanden, war mit identischen STs zu rechnen. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurden die Isolate herdenweise anhand ihres SmaI-Restriktionsmusters zu Clustern mit einem Cut-off Wert von ≥ 90 % Ähnlichkeit zusammengefasst und mindestens ein Isolat pro Cluster mittels Multilocus-Sequence-Typing (MLST) typisiert. Insgesamt wurden 130 Campylobacter-Isolate per MLST analysiert. Es wurden 47 unterschiedliche STs nachgewiesen. 17 STs und das Allel glyA-303 wurden erstmals im Rahmen dieser Untersuchungen beschrieben. Innerhalb der Herden wurden für die Isolate zwischen zwei und sieben unterschiedliche STs ermittelt. Beim Vergleich der Allelsequenzen der Housekeeping-Gene fielen einige Allele durch eine hohe Rate an Nukleotidsubstitutionen auf. Die Allele konnten C. coli-Isolaten zugeordnet werden. Im UPGMA-Dendrogramm auf Basis der Allelprofile traten identische STs wiederholt in Herden verschiedener Mäster auf. Im Minimum-Spanning-Tree waren zwei deutlich von einander abgegrenzte Gruppen erkennbar: Der einen Gruppe gehörten ausschließlich C. coli-Isolate und der anderen nur C. jejuni-Isolate an. In der Gruppe der C. coli-Isolate wurde ein großer klonaler Komplex ermittelt, dem 10 der 15 STs angehörten; die restlichen fünf STs konnten keinem klonalen Komplex zugeordnet werden (Singletons). In der Gruppe der C. jejuni-Isolate wurden 15 STs als Singletons identifiziert. Die übrigen 17 STs teilten sich auf sieben klonale Komplexe auf. Sowohl beim Vergleich der Allelsequenzen als auch im Minimum-Spanning-Tree wurde die höhere genetische Diversität von C. jejuni-Isolaten im Vergleich zu C. coli-Isolaten deutlich. Innerhalb einer Herde traten verschiedene Campylobacter-Genotypen auf. Anhand des erstellten UPGMA-Dendrogramms auf Basis der Allelmuster konnte ein generelles Vorkommen mästerspezifischer Campylobacter-Genotypen ausgeschlossen werden.

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Langen, Marcus: Phylogenetische Charakterisierung von Campylobacter-Isolaten aus der Geflügelschlachtung. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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