Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der initialen Phase der bovinen Mastitis

Meyer, Sonja

 Mastitis is the economically most important illness afflicting single animals in dairy farming. The current knowledge about early stage pathogen-host interactions has been insufficient to develop successful concepts for prophylaxis and therapy so far. Forming part of a cumulative research project on mastitis the present study was designed to examine in a comparative manner interactions of pathogens, mammary gland epithelial cells and somatic cells during the early stages of inflammation. For that purpose an experimental in vivo infection model was established for Staphylococcus aureus and Escherichia coli, two of the most common pathogens causing clinical mastitis in cattle. Parallel in vitro studies were conducted to determine the impact of early pathogen-host-interactions on the regulation of PMN-viability. For the in vivo experiments only cows of a defined age, stage of lactation and somatic cell count (SCC) were used. The quality of the developed model system for mastitis was based on strict exclusion of any animals not meeting the demands (Breed: Holstein Friesian, 1. lactation, 3.-5. month of lactation, no evidence of mastitis related pathogens in the milk and a SCC <50.000 cells/ml at least three weeks before commencement of the trials). Thus it was possible to observe initial signal and defence mechanisms (24 respectively 72 h) of an acute clinical mastitis (E. coli) and a subclinical to chronic mastitis (S. aureus) with great accuracy and reproducibility. As controls the cell composition in the milk of non infected animals selected by the same strict exclusion criteria were analysed using the same time frame (‚gold standard animals’). The cells which migrated into the milk of infected and non infected animals were phenotyped and the concentration of histamine as well as a subset of cytokines was examined. The second part of the study consisted of in vitro trials examining the modulation of apoptosis and necrosis of neutrophilic granulocytes. The functional capacity of these classical phagocytes depends to a great extend on the regulation of their life span within the mammary gland. A method for flow cytometric evaluation of mitochondrial membrane potentials was established facilitating a differentiated assessment of  PMN viability. In summary the in vivo infection model developed in the present study identified several effector cells which play a key role in the initial phase of E. coli- und S. aureus-induced mastitis. Neutrophilic granulocytes as the dominating leukocyte fraction seem to be of special importance. In the milk of healthy and infected quarters an abundance of factors were found which were able to influence in vitro the PMN viability and reactivity. The results represent a valuable basis for further studies with the aim of developing an efficient prophylaxis and therapy of bovine mastitis.

Die Mastitis ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzeltiererkrankung in der Milchproduktion. Bisher konnten frühe Erreger-Wirts-Interaktionen nicht hinreichend geklärt werden, um zufrieden stellende Prophylaxe- und Therapiekonzepte zu entwickeln. Im Rahmen eines wissenschaftlichen Gesamtkonzeptes sollte diese Arbeit dazu beitragen, die Interaktion zwischen Erregern, Milchdrüsenepithelzellen und somatischen Zellen der Milch in der frühen Entzündungsphase vergleichend zu untersuchen. Dazu wurde ein experimentelles In-vivo-Infektionsmodell für Staphylococcus aureus und Escherichia coli, den häufigsten Erregern klinischer Mastitiden beim Rind, etabliert. Begleitend wurden im Rahmen von In-vitro-Studien frühe Erreger-Wirts-Interaktionen auf ihre Bedeutung für die Regulation der Vitalität von neutrophilen Granulozyten untersucht. Es wurde ein Mastitis-Modellsystem verwendet, in dem Tiere definierten Alters, Laktationsstadiums und Milchzellzahl eingesetzt wurden. Die Qualität des entwickelten Mastitis-Modells begründete sich auf den strengen Auswahlkriterien (Rasse: Holstein Friesian, 1. Laktation, 3.-5. Laktationsmonat, Freiheit von Mastitiserregern sowie somatische Zellzahl in der Milch [SCC] <50.000 Zellen/mL über mindestens drei Wochen vor Versuchsbeginn). Damit sollten mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit initiale Signal- und Abwehrmechanismen in der frühen Phase (24 bzw. 72 h) einer akuten klinischen (E. coli) und einer subklinischen bis chronischen (S. aureus) Mastitis erfasst werden. Das Modell umfasste darüber hinaus die Analyse von nicht-infizierten Tieren (‚Goldstandardtiere‘), welche den Modellgrenzen entsprachen, um zu prüfen inwieweit sich Zellzusammensetzungen während einer 24- und 72-stündigen Beobachtungs­zeit verändern. Im Zuge aller Untersuchungen wurden die immigrierenden Zellen hinsichtlich ihres Phänotyps charakterisiert sowie Änderungen der Konzentration löslicher Milchinhaltsstoffe (Zytokine und Histamin) bestimmt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde in vitro die Modulation der Apoptose und der Nekrose von neutrophilen Granulozyten geprüft. Von der Regulation der Lebensspanne dieser Effektorzellen hängt entscheidend ihre funktionelle Kapazität in der Milchdrüse ab. Durch die Etablierung eines durchfluss­zytometrischen Verfahrens zum Nachweis depolarisierter Mitochondrien­membranen konnte die Beurteilung der Vitalität differenziert betrachtet werden. Zusammenfassend konnten anhand des im Rahmen dieser Studie etablierten In-vivo-Infektionsmodells verschiedene Effektorzellen, insbesondere neutrophile Granulozyten, identifiziert werden, die eine Schlüsselrolle in der Frühphase E.-coli- und S.-aureus-induzierter Mastitiden einnehmen. In der Milch gesunder und infizierter Euterviertel konnte zudem eine Vielzahl von Faktoren ermittelt werden, die im In-vitro-Modell die Lebenspanne dieser Effektorzellen und damit ihre potentielle Reagibilität im Euter beeinflussen. Diese Erkenntnisse stellen eine wertvolle Grundlage für weitere Studien im Hinblick auf die Entwicklung effizienter Prophylaxe- und Therapiekonzepte der bovinen Mastitis dar. 

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Meyer, Sonja: Untersuchungen zur Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der initialen Phase der bovinen Mastitis. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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