Thiamin und Thiaminphosphate in der Muskulatur von Schweinen und in Schweinefleischprodukten

Poel, Cornelia

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Thiamin und Thiaminphosphate in der Muskulatur von Schweinen und in Schweinefleischprodukten

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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Thiamin- und Thiaminphosphatgehalte in Schweinefleisch und Schweinefleischprodukten bestimmt. Vorraussetzung für die gleichzeitige Bestimmung aller Substanzen war die Entwicklung einer neuen Festphasenextraktion und einer neuen HPLC-Methode, die es erstmalig ermöglichten, Thiamin und seine Phosphatester aufzureinigen und ohne Störpeaks, in angemessener Zeit bei gleichzeitig guter Trennleistung im Chromatogramm darzustellen. Die neu entwickelte Festphasenextraktion war gekennzeichnet durch eine SAX- und eine C-18-ec-Säule. Die Kombination beider Säulen ermöglichte eine gute Retardierung von Thiamin und Thiaminphosphaten und ermöglichte erstmals eine simultane Aufreinigung der Substanzen aus einer komplexen Matrix wie Schweinefleisch. Grundlage der neu entwickelten HPLC- Methode war die Kombination einer C-8-RP-Säule mit einer NH2-ec-Säule. Beide Säulen verfügten über völlig unterschiedliche Trennmechanismen und ermöglichten es erstmalig, Thiamin, Thiaminmonophosphat, Thiamindiphosphat, Thiamintriphosphat und Thiamintetraphosphattrotz ihrer unterschiedlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften simultan zu trennen. T und Thiaminmonophosphat traten in Wechselwirkung mit der unpolaren C-8-RP-Säule, während die anderen Analyten aufgrund ionischer Wechselwirkungen an die NH2-ec-Säule gebunden wurden. Das zunächst angewandte isokratische System wurde durch eine Gradientenelution ersetzt, die eine Optimierung der Retentionszeiten, sowie eine Säulenschonung bewirkte. Die Nachweisgrenze lag für T bei 0,3 ng/mL, für TP bei 0,5 ng/mL und für TP2 bei 0,9 ng/mL. Durch Ermittlung eines Extrapolationsverfahrens konnte eine halbquantitative Abschätzung der Gehalte von Thiaminphosphaten (z. B. Thiamintriphosphat und Thiamin-tetraphosphat) vorgenommen werden. Für diese Substanzen sind keine Kalibrations-standards käuflich zu erwerben. Nach Entwicklung der Methode wurde Schweinefleisch direkt nach der Schlachtung (30 min post mortem) auf seinen Thiamingesamtgehalt analysiert. Der Gehalt war definiert als Summe aller extrahierbaren Thiaminbindungsformen und nahm innerhalb von 24 Stunden kontinuierlich ab. Nach 48 Stunden war jedoch ein erneuter Anstieg zu verzeichnen, der bis zum letzten Messtag der Rohwurst 122 Tage post mortem belegt werden konnte. Eine Analyse der Thiaminphosphate ergab, dass die Anteile der Phosphate am Thiamingesamtgehalt nicht konstant blieben. So waren im Fleisch 30 min. post mortem vor allem Thiamintriphosphat und eine weitere zunächst noch nicht näher identifizierbare 5. Substanz für den Thiamingesamtgehalt verantwortlich. In den folgenden Stunden transformierten die Thiaminphosphate, so dass während der weiteren Fleischreifung vor allem Thiamin, Thiaminmonophosphat und Thiamindiphosphat vorhanden waren. Die Analyse der Thiaminphosphate ergab weiterhin, dass der Anstieg des extrahierbaren Thiamingesamtgehaltes nach 48 Stunden auf einen Anstieg des Gehaltes an freiem Thiamin zurückzuführen war, der nachfolgend im Schweinefleischprodukt den Hauptanteil stellte. Da nicht von einer Genese des freien Thiamins in totem biologischem Material auszu-gehen war, musste das Thiamin vorher in einer durch 4 %ige TCA nicht extrahierbaren Bindungsform vorgelegen haben. Im Zuge der Fleischreifung wurde das Thiamin freigesetzt, war erst dann analysierbar und führte so zu einem vermeintlichen Anstieg des Thiamingesamtgehaltes. Vermutlich war der zu Beginn registrierte Abfall des Gehaltes durch Umformungen in die nicht extrahierbare Bindungsform bedingt, so dass der absolute Gehalt gleich blieb, aber nicht zu jedem Zeitpunkt extrahierbar war. Die erstmalige Aufklärung der Kinetik der Thiaminphosphate lieferte einen ersten Hinweis auf die Identifizierung der unbekannten 5. Substanz, die sich ähnlich wie die Thiaminphosphate verhielt. Weiterhin führte unter anderem die im Vergleich zu den anderen Thiaminphosphaten längere Retentionszeit zu der begründeten Annahme, dass es sich um eine neue Thiaminbindungsform handelte. In den analysierten Schweinefleischprodukten war fast ausschließlich freies Thiamin bestimmbar. Eine Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Zusatzstoffen auf den extrahierbaren Thiamingesamtgehalt zeigte nur beim 3 %igen Nitritpökelsalz eine analysierbare, signifikante Abnahme, andere Zusatzstoffe führten zu keinen signifikanten Änderungen des Thiamingesamtgehaltes im Vergleich zur undotierten Probe. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Thiamingehalte während der Fleisch‑ und Rohwurstreifung gleich blieben. Eine vermeintliche Abnahme durch Verringerung des TP3‑Gehaltes bereits wenige Stunden post mortem war durch eine Biotransfomation dieser Bindungsform in eine nicht extrahierbare proteingebundene Form erklärbar, aus der das Thiamin nach mehreren Tagen Fleischreifung in Form des freien Thiamins wieder freigesetzt wurde und zu einem Anstieg des extrahierbaren Thiamingesamtgehaltes führte. Die Aufklärung der Kinetik der Thiaminphosphate in Schweinefleisch durch Erforschung ihrer Transformationsvorgänge in Schweinemuskulatur nach der Schlachtung und während der Rohwurstreifung ist hiermit erstmalig gelungen.

The present study describes the contents of thiamin and thiamin phosphate esters in pork and products made of pork. Before measurements could start, a new solid phase extraction and a new HPLC‑method had to be developed, due to methods published in literature did not lead to satisfying results. The new developed solid phase extraction combined a SAX- and C-18-ec column, which led to an improved retardation of thiamin and thiamin phosphate esters, resulting in a firstly described simultaneous purification of these substances from complex matrices like pork. After purification was optimised, a new HPLC‑method was developed aiming a simultaneous measurement of thiamin and thiamin phosphate esters in an acceptable operational time, including a high‑specific separation of all substances. Precondition for developing a new HPLC-method was the combination of a C-8-RP-colum with a NH2-ec-colum. Both columns were characterised by totally different separation mechanisms permitting in combination a simultaneous differentiation of thiamin and its phosphate esters in spite of their different chemical characteristics for the first time. Unphosphorylated thiamin and thiamin monophosphate were in interaction with the covalent C-8-RP-colum whereas the other analytes reacted with the NH2-ec-colum due to their ionic state. Next, the former used isocratic system was exchanged by solutions of gradients which resulted in an improvement of retention time and prolonged the life of the columns. The limit of detection for thiamin was 0.3 ng/mL, for thiamin monophosphate 0.5 ng/mL and for thiamin diphosphate 0.9 ng/mL. Thiamin triphosphate as well as thiamine tetraphosphate were calculated by a special extrapolation method, that allowed a semi‑quantitative determination which was necessary because both substances were not available as standard substances any more. After developing the new method, pork was analysed immediately after slaughtering (30 min. post mortem) for its total thiamin content which was defined as a sum of all extractable binding forms of thiamine. The extractable total thiamin content seemed to decline continuously within 24 hours. After 48 hours an increase of extractable thiamin binding forms was measured up to 122 days post mortem in raw sausage. Additionally the analysis of all extractable thiamin binding forms revealed an inconstant concentration of thiamin phosphate esters. In meat 30 min post mortem the main content of thiamin phosphate esters consisted of thiamin triphosphate and besides that an unknown fifth substance was detected. In the subsequent hours of measurement a transformation of thiamin phosphate esters was recognised with an increase of non phosphorylated thiamin, thiamin monophosphate and thiamin diphosphate as main binding forms. The apparently increasing content of total thiamine after 48 hours was due to an increasing concentration of non phosphorylated thiamin which finally obtained the main content in products made of pork.Because the content of detectable non phosphorylated thiamin in pork was higher, than could be explained by transformation reactions the existence of a binding form that was not extractable by 4 % TCA was assumed. With the progress of meat maturation non phosphorylated thiamin was released from this binding form and thus detectable, leading to an seeming increase of total thiamin. In conclusion the initially registered decrease of total thiamin content could be due to a transformation of thiamin into this non-extractable binding form. This presumption resulted in the fact that the content of total thiamin during maturation of meat and raw sausage remained equal, but, already some hours after slaughtering, some of the thiamin phosphate esters transform into a non extractable binding form, that avoids their detection. The clarification of the kinetics of thiamine phosphat esters after slaughtering furnished the first evidence for identification of the fifth unknown substance which was similar in its chemical state to the thiamin phosphate esters. The prolonged retention time of this unknown substance in comparison to the known thiamin phosphate esters, supports the assumption that a new thiamine binding form was detected. An investigation about the influence of different additives on extractable total thiamin content revealed that only 3 % nitrite curing salt additive results in a significant decrease of total thiamin content. To sum up all evaluated results, total thiamin content did not change during maturation of pork and raw sausage, but the content of thiamine phosphate esters did change remarkably. The decrease of thiamin triphosphate content after only a few hours could be due to biotransformation of the origin state into a non-extractable protein-bound form, leading to a decrease of measurable total thiamine content. From this form thiamin was released after a few days of pork maturation leading to a measurable new increase of extractable total thiamine content. The clarification of the kinetics of thiamine phosphate esters in pork was possible for the first time, due to investigation of the transformation procedures of thiamin phosphate esters in pork after slaughtering and during maturation of meat and raw sausage.