Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Histamin H4-Rezeptor auf murinen dendritischen Zellen und in Modellen der allergischen Dermatitis

Wendorff, Stephanie

In the present study we investigated the influence of histamine, histamine receptor agonists and histamine receptor antagonists, especially that of the histamine H4-receptor antagonist JNJ7777120 on dendritic cell function and in models of allergic contact dermatitis. The in-vitro-experiments were carried out with bone marrow derived dendritic cells from two different strains of mice, as it was demonstrated in scratching experiments that NRMI-mice are more susceptible to H4-receptor-mediated itch than BALB/c-mice. As a basic requirement for the following experiments the presence of the histamine H4-receptor on murine dendritic cells was shown by means of real time RT-PCR. Murine bone marrow derived dendritic cells express the mRNA of the histamine H4-receptor. While the histamine H1-receptor and histamine H2-receptor was also be detected, mRNA of the histamine H3-receptor was found to be low or undetectable. A polyclonal rabbit anti-human H4R-antibody was used to confirm the expression of the histamine H4-receptor on the protein level by flow cytometric analysis. The influence of histamine on the cytokines interleukin-12 and interleukin-10 was examined in vitro. While histamine (10-3 mol/l) lead to a decrease of LPS-induced interleukin-12-secretion, it enhanced LPS-induced elevation of interleukin-10-production. The enhanced cytokine-production was blocked by the specific H4R-antagonist JNJ7777120 and the H1R-antagonist diphenhydramine. One of the pivotal roles of dendritic cells within the scope of allergic inflammations is the migration to the draining lymph nodes to present their antigens to naïve t-cells. The influence of histamine and the histamine H4R-agonist clobenpropit on migration was investigated in vitro and by means of a skin migration assay. Histamine as well as clobenpropit lead to a significantly increased migration of both in vitro generated dendritic cells as well as dermal and epidermal dendritic cells out of ear skin. The above findings and the fact, that the enhanced chemotaxis was blocked by JNJ7777120 suggest a major participation of the histamine H4-receptor. In all investigated parameters there were no distinct differences between NMRI and BALB/c-mice, indicating that a higher susceptibility to histamine is not associated with a generally higher histamine H4-receptor expression in all cell types. In vivo efficacy of antihistamines was analysed in models of allergic contact dermatitis, which differ in their Th1-/Th2-dominance, during the sensitization phase and the elicitation phase. The inflammatory hapten-induced ear swelling as well as the cellular reaction in the draining lymph nodes (weight, number of total cells, rate of CD11c/CD40 positive cells) were used as functional parameters. Another priority was the migration of dendritic cells out of ear skin. With the administered doses (thioperamide 7,5/10/15 mg/kg body weight; diphenhydramine 30 mg/kg body weight; ranitidine 30 mg/kg body weight; JNJ7777120 15 mg/kg body weight) neither histamine H3R/H4R-antagonist thioperamide on its own nor the combination of thioperamide, diphenhydramine and ranitidine (and therefore a block of all four known histamine receptors) nor the specific H4R-antagonist JNJ7777120 showed an antiinflammatory effect in models of allergic contact dermatitis. Furthermore, neither the topical nor the systemic application of clobenpropit lead to an increase of inflammatory ear swelling. The lack of efficacy was consistent in every investigated parameter. In conclusion, the results of the in-vitro-studies show an influence of histamine on dendritic cell function mediated through the histamine H4-receptor. However, compared with human cells, much higher concentrations of histamine are required for these effects. The question whether models of allergic contact dermatitis are suitable for the evaluation of new antihistamines for the treatment of allergic contact dermatitis or atopic dermatitis cannot be completely answered. Based on the present study, it should be considered when transfering the results from mice to men, that the role of histamine in mice might be a subordinate one.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Histamin, Histaminrezeptoragonisten und Histaminrezeptorantagonisten, insbesondere des spezifischen Histamin H4-Rezeptor-antagonisten JNJ7777120 auf die dendritische Zellfunktion und ihre Wirkung in Modellen der allergischen Kontaktdermatitis untersucht. Die In-vitro-Untersuchungen wurden mit dendritischen Zellen zweier verschiedener Mausstämme durchgeführt, da sich die NMRI-Maus in Vorversuchen zum juckreizinduzierten Kratzverhalten als histaminsensitiver als die BALB/c-Maus erwies. Als Vorraussetzung für die weiteren Versuche wurde zunächst mittels real time RT-PCR der Nachweis des Histamin H4-Rezeptors auf mRNA-Ebene geführt. Murine bone marrow derived dendritic cells exprimieren den Histamin H4-Rezeptor. Der Histamin H1-Rezeptor und der Histamin H2-Rezeptor konnten ebenfalls detektiert werden, nicht aber der Histamin H3-Rezeptor. Zur Bestätigung der Existenz des Histamin H4-Rezeptors auf Proteinebene kam ein polyklonaler rabbit anti-human H4R-Antikörper zum Einsatz.  In vitro wurde der Einfluss von Histamin auf die Zytokine Interleukin-12 und Interleukin-10 untersucht. Histamin führt in einer Konzentration von 10-3 mol/l zu einer Suppression der durch LPS induzierten Interleukin-12-Sekretion, während es die nach LPS erhöhte Interleukin-10-Produktion nochmals steigert. Die vermehrte Sekretion kann durch JNJ7777120 und den H1R-Antagonisten Diphenhydramin aufgehoben werden. Da eine der wichtigsten Aufgaben dendritischer Zellen im Rahmen allergischer Entzündungen darin besteht, in die regionären Lymphknoten zu emigrieren, um dort naiven T-Zellen ihr Antigen zu präsentieren, wurde der Einfluss von Histamin und des Histamin-H4R-Agonisten Clobenpropit auf die Migration in vitro und in einem Skin Migration Assay untersucht. Sowohl Histamin als auch Clobenpropit führen zu einer signifikant gesteigerten Migration von in vitro generierten dendritischen Zellen und von dermalen und epidermalen dendritischen Zellen aus dem lebenden Ohrgewebe heraus. Die Hemmung der Migration durch JNJ7777120 spricht für eine hauptsächliche Beteiligung des Histamin H4-Rezeptors. In allen untersuchten Parametern zeigt sich kein Unterschied zwischen den zwei Mausstämmen, so dass deren unterschiedliche Histaminsensitivität nicht auf eine verschieden starke Histamin H4-Rezeptorexpression in den Zellen zurückzuführen ist. In vivo wurde der Einfluss verschiedener Antihistaminika in murinen Kontakt-allergiemodellen, welche sowohl Th1- als auch Th2-dominierte Entzündungen abdecken, in der Sensibilisierungsphase und in der Challengephase untersucht. Als Entzündungsparameter wurden dabei die entzündliche Ohrschwellung, die zelluläre Reaktion im regionären Lymphknoten (Gewicht, Gesamtzellzahl, Anteil CD11c/CD40 positiver Zellen) und die Migration dendritischer Zellen im Skin Migration Assay betrachtet. In den verwendeten Konzentrationen (Thioperamid 7,5/10/15 mg/kg Körpergewicht; Diphenhydramin 30 mg/kg Körpergewicht; Ranitidin 30 mg/kg Körpergewicht; JNJ7777120 15 mg/kg Körpergewicht) zeigen weder Thioperamid allein noch die Kombination von Thioperamid, Diphenhydramin und Ranitidin (und somit eine Blockade aller Histaminrezeptoren) noch JNJ7777120 eine antiinflammatorische Wirksamkeit in den Kontaktallergiemodellen. Weder die topische noch die systemische Applikation von Clobenpropit führt zudem zu einem Anstieg der entzündlichen Ohrschwellung. Die fehlende Wirksamkeit spiegelt sich in allen untersuchten Parametern wider. Insgesamt zeigen die Ergebnisse der In-vitro-Untersuchungen einen Einfluss von Histamin durch den H4-Rezeptor auf die Funktion dendritischer Zellen. Verglichen mit humanen Zellen sind für die beobachteten Effekte sehr hohe Histaminkonzentrationen erforderlich. Ob murine Kontaktallergiemodelle für die Evaluierung neuer Antihistaminika zur Behandlung der allergischen Kontaktdermatitis oder der atopischen Dermatitis geeignet sind, kann abschließend nicht bewertet werden. Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen sollte bei der Übertragung der Ergebnisse von der Maus auf den Mensch aber bedacht werden, dass die Rolle von Histamin in der Maus eine untergeordnete sein könnte.

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Wendorff, Stephanie: Untersuchungen zum Histamin H4-Rezeptor auf murinen dendritischen Zellen und in Modellen der allergischen Dermatitis. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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