Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Regulation of C5a-mediated effects on innate immune functions during experimental sepsis

Wrann, Christiane D.

Sepsis is a very severe disease with a high risk of fatality since effective therapeutic options are not available up to now. Despite intense research in the last years a profound understanding of the underlying pathophysiology is still lacking. There is increasing evidence that the proinflammatory complement split product C5a which is generated in excessive amounts during the onset of sepsis plays an important role in many harmful effects and blockade of either C5a or C5aR leads to greatly improved survival of rodents in experimental sepsis. C5a has been shown to affect innate immune functions, such as generation of inflammatory mediators as well neutrophils functions, leading to a status of immune suppression. Recent studies demonstrated that C5a alters intracellular signaling pathways in neutrophils in vitro and during the onset of sepsis in vivo, offering an explanation for the above mentioned suppression of innate immune functions. Therefore, we conducted these studies to investigate the involvement of different important signaling pathways in the regulation of the C5a-mediated effects on the innate immune response in experimental sepsis. Recent studies suggested an important but controversial role of the PI3K/Akt signaling pathway in acute and chronic inflammation therefore we investigated the effects of inhibition of this cell signaling pathway on innate immunity during the onset of sepsis. Sepsis in C57/Bl6 mice was induced by cecal ligation and puncture (CLP). Inhibition of the PI3K pathway in vivo with the specific PI3K inhibitor LY249002 resulted in increased mortality of septic mice accompanied by strongly elevated serum levels of TNFα, IL-6, MCP-1 and IL-10 as well as decreased oxidative burst activity in blood phagocytes. PI3K inhibition in vitro resulted in significant increases in TLR-4-mediated generation of various proinflammatory cytokines in cultured human neutrophils, whereas the opposite effect was observed in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Oxidative burst and phagocytosis activity was significantly attenuated in both, human neutrophils and monocytes when PI3K activation was blocked. In addition, PI3K inhibition resulted in strongly elevated TLR-4-mediated generation of IL-1β and IL-8 in cultured human neutrophils when these cells were costimulated with C5a. C5a-induced priming effects on neutrophil and monocyte oxidative burst activity as well as C5a-induced phagocytosis in neutrophils were strongly reduced when PI3K activation was blocked. This data suggest that the PI3K/Akt signaling pathway controls various C5a-mediated effects on innate immunity and exerts an overall protective effect during sepsis. Effective priming of the oxidative burst is essential for successful killing of invading microbes in the onset of sepsis. Therefore, we further investigated the involvement of other important signaling pathways, the ERK1/2, p38 MPAK, JNK, and the PKC signaling pathways, in the C5a-mediated priming of oxidative burst in human blood neutrophils and monocytes. ERK1/2 inhibition strongly reduced the C5a-mediated priming of both, E. coli- and PMA-induced oxidative burst in phagocytes, whereas p38 MAPK inhibition only impaired C5a-induced priming of E. coli-induced oxidative burst. Blockade of PKC on the other hand resulted in decreased C5a-mediated priming of PMA-induced oxidative burst. For ERK1/2 and p38 inhibition, the baseline burst activity after E. coli or PMA stimulation was clearly reduced. JNK inhibition had no effect on the baseline burst activity or on C5a-mediated priming. Our findings suggest burst-inductor specific involvement of p38 MAPK and PKC signaling in C5a-mediated priming of oxidative burst in neutrophils and monocytes. In contrast, the role of ERK1/2 signaling appears to be generally important for C5a-mediated priming of oxidative burst in these cells independently of the burst inducing stimulus. Our results demonstrate for the first time distinct involvement of ERK1/2, p38 and PKC pathways for C5a-induced priming of oxidative burst in phagocytes. In conclusion, this study demonstrated that the PI3K signaling pathway exerts protective effects during sepsis by controlling C5a-mediated activation of innate immune functions and the signaling pathways ERK1/2, p38 and PKC are distinctly involved in the C5a-induced priming of oxidative burst in phagocytes. These findings provide new insight into the pathophysiology of sepsis and identify the PI3K/Akt pathway as a potential therapeutic target for the treatment of sepsis.

Sepsis ist eine äußerst schwere Erkrankung, die mit einem hohen Mortalitätsrisiko behaftet ist, da leider bis heute keine effektiven Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen. Trotz intensiver Forschungsbemühungen in den letzten Jahren ist die der Erkrankung zugrundeliegende Pathophysiologie immer noch weitgehend unverstanden. Allerdings mehren sich die Beweise, dass das Komplementspaltprodukt C5a, welches in großen Mengen in der Frühphase der Sepsis produziert wird, eine wichtige Rolle für viele schädigende Effekte spielt. Die Blockade von C5a selbst oder seinem C5a Rezeptor verbessert deutlich das Überleben von Nagern nach experimentell induzierter Sepsis. Es wurde weiterhin gezeigt, dass C5a in der Lage ist die angeborene Immunantwort zu beeinflussen, wie beispielsweise die Generierung von Entzündungsmediatoren oder die Immunfunktionen von neutrophilen Granulozyten, was letztlich zu einem Status der Immunsuppression führt. Neuere Studien weisen darauf hin, dass C5a die intrazelluläre Signaltransduktion in neutrophilen Granulozyten in vitro und in vivo während der Frühphase der Sepsis beeinflusst. Diese Beobachtung wäre eine mögliche Erklärung für die bereits oben erwähnte Suppression der angeborenen Immunfunktionen. Ziel dieser Studie war es, die Beteiligung verschiedener wichtiger intrazellulärer Signaltransduktionswege an der Regulation der C5a-vermittelten Effekte auf die angeborene Immunantwort bei experimentell induzierter Sepsis zu untersuchen. Neuere Studien zeigen, dass der PI3K/Akt Signaltransduktionsweg wichtige, aber gegensätzliche Funktionen bei akuten und chronischen Entzündungen hat. Aus diesem Grund wollten wir die Effekte der Inhibition dieses Signaltransduktionsweges auf die angeborene Immunantwort in der Frühphase der Sepsis untersuchen. In C57/Bl6 Mäusen wurde mittels Caecumligation und Punktion (CLP) eine Sepsis induziert. Inhibition des PI3K Signalweges in vivo mit dem spezifischen PI3K Inhibitor LY429002 erhöhte deutlich die Mortalität bei diesen septischen Mäusen. Damit assoziiert war eine signifikante Erhöhung der Serumspiegel an TNFα, IL-6, MCP-1 und IL-10, ebenso wie eine erniedrigte Aktivität des Oxidative Burst in Blutphagozyten. Die PI3K Inhibition in vitro führte zu einem signifikanten Anstieg der TLR-4-vermittelten Produktion verschiedener proinflammatorischer Zytokine in kultivierten humanen neutrophilen Granulozyten. Der gegenteilige Effekt wurde bei peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) beobachtet. Oxidativer Burst und Phagozytose bei humanen neutrophilen Granulozyten als auch Monozyten waren nach einer Blockade der PI3K Aktivierung signifikant abgeschwächt. Außerdem resultierte eine PI3K Inhibition in einer verstärkten TLR-4-vermittelten Produktion von IL-1β and IL-8 in kultivierten humanen neutrophilen Granulozyten bei erfolgter Kostimulation mit C5a. Das C5a-vermittelte Priming des Oxidativen Burstes von neutrophilen Granulozyten und Monozyten als auch das C5a-vermittelte Priming der Phagozytosefähigkeit von neutrophilen Granulozyten war bei blockierter PI3K Aktivierung deutlich reduziert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der PI3K/Akt Signaltransduktionsweg verschiedene C5a-vermittelte Effekte auf die angeborenen Immunfunktionen kontrolliert und insgesamt eine protektive Funktion während der Sepsis ausübt. Ein effektives Priming des Oxidativen Burstes ist essentiell für die erfolgreiche Bekämpfung von eindringenden Keimen während der Frühphase der Sepsis. Daher haben wir die Beteiligung weiterer wichtiger Signaltransduktionswege, des ERK1/2, p38 MAPK, JNK und des PKC Signaltransduktionswege am C5a-vermittelten Priming des Oxidativen Burstes von humanen neutrophilen Granulozyten und Monozyten im Blut untersucht. Inhibition von ERK1/2 reduzierte deutlich das C5a-vermittelte Priming sowohl des E. coli- als auch des PMA-induzierten Oxidativen Burstes in Phagoyzten. Dagegen bewirkte die Inhibition von p38 MAPK nur eine Beeinträchtigung des C5a-vermittelten Primings des E. coli-induzierten Oxidativen Burstes. Andererseits führte eine Blockierung von PKC nur zu einer Verminderung des C5a-vermittelten Primings des PMA-induzierten Oxidativen Burstes. Nach ERK1/2 und p38 Inhibition war die Grundaktivität des Oxidativen Burstes sowohl bei E. coli- als auch bei PMA-Stimulation herabgesetzt. JNK-Inhibition hatte keine Wirkung weder auf die Grundaktivität des Oxidativen Burstes, noch auf das C5a-vermittelte Priming. Unsere Ergebnisse weisen auf eine Burstinduktor-spezifische Beteiligung des p38 MAPK- und PKC-Signalweges beim C5a-vermittelten Priming des Oxidativen Burst von neutrophilen Granulozyten und Monozyten hin. Im Gegensatz dazu scheint der ERK1/2 Signalweg eine generelle Bedeutung für das C5a-vermittelte Priming des Oxidativen Burstes von diesen Zellen zu haben, unabhängig vom Burst auslösenden Stimulus. Unsere Studie hat damit zum ersten Mal eine distinkte Beteiligung der ERK1/2-, p38- und PKC-Signalwege am C5a-induzierte Priming des Oxidativen Burstes in Phagozyten nachgewiesen. Zusammenfassend hat unsere Studie gezeigt, dass der PI3K Signalweg einen protektiven Effekt während der Frühphase der Sepsis hat, indem er die C5a-vermittelte Aktivierung der angeborenen Immunfunktionen kontrolliert und dass die Signalwege ERK1/2, p38 und PKC differentiell am C5a-induzierten Priming des Oxidativen Burstes in Phagozyten beteiligt sind. Diese Ergebnisse gewähren neue Einblicke in die Pathophysiologie der Sepsis und identifizieren den PI3K/Akt Signalweg als einen neuen möglichen therapeutischen Angriffspunkt für die Behandlung von septischen Patienten.

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Wrann, Christiane D.: Regulation of C5a-mediated effects on innate immune functions during experimental sepsis. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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