Konstruktion und Charakterisierung isogener Actinobacillus pleuropneumoniae FrdA- und FrpB-Mutanten

Bendalla, Ibrahim Mohamed

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Konstruktion und Charakterisierung isogener Actinobacillus pleuropneumoniae FrdA- und FrpB-Mutanten

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Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist der Erreger einer wirtschaftlich bedeutsamen Pleuropneumonie der Schweine, die mit zunehmender Intensivierung der Schweinehaltung an Bedeutung gewinnt. Eine verstärkte Untersuchung der Pathogenesemechanismen führte zu den Hypothesen, dass i) die fehlende Aufregulation der Fumaratsynthese und die dadurch bedingte reduzierte Fähigkeit zur Fumaratatmung an der Attenuierung einer A. pleuropneumoniae ArcA-Mutante und ii) die fehlende Aufregulation des FrpB Proteins an der Attenuierung einer A. pleuropneumoniae HlyX-Mutante beteiligt ist (HlyX ist das A. pleuropneumoniae FNR-Homolog). In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Allelaustausch isogene A. pleuropneumoniae Fumaratreduktase (frdA) und „ferric-regulated protein B“ (frpB) Mutanten konstruiert. Beide Mutanten tragen in-frame Mutationen und keinerlei Fremd-DNA. Auf genetischer Ebene wurden sie durch PCR, Southern Blot und DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Durch PFGE wurden genomische Rearrangements ausgeschlossen. Zusätzlich wurde der Phänotyp durch Enzymaktivitätstest (FrdA) bzw. durch Auftrennung von Außenmembranen in der SDS-PAGE (FrpB) überprüft und die Spezifität der jeweiligen Deletion wurde durch Plasmid-gestützte Komplementation in trans gezeigt. Die Virulenz beider Mutanten wurde in einem Aerosolinfektionsmodell am Schwein geprüft. Dabei wurde gezeigt, dass die FrdA Mutante in Bezug auf die klinischen Erscheinungen und den Lungenläsionsscore signifikant attenuiert war und zudem ein gegenüber dem Elternstamm deutlich verringertes Persistenzvermögen aufwies. Die FrpB Mutante war vollständig attenuiert und nicht mehr in der Lage, die Lunge oder die Tonsillen des Wirtes zu besiedeln. Somit konnten die beiden der Arbeit zugrunde liegenden Hypothesen bestätigt werden. Allerdings sind insbesondere zur Klärung der Funktion des FrpB Proteins, dessen Fehlen eine unerwartet starke Attenuierung des Erregers auslöste, zukünftig weitere Arbeiten erforderlich.

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae causes Porcine Pleuropneumonia, a highly contagious disease with high economic importance particularly in intensive pig farming. An ongoing investigation of pathogenicity mechanisms led to the hypotheses that i) the missing upregulation of fumarate synthesis and, thereby, the reduced ability for fumarate respiration might be partly responsible for the attenuation of an A. pleuropneumoniae arcA mutant and ii) the missing upregulation of the FrpB protein might be associated with the attenuation of an A. pleuropneumoniae hlyX mutant (HlyX is the FNR-homologue of A. pleuropneumoniae). In the work presented isogenic A. pleuropneumoniae mutants of the fumarate reductase (frdA) and the ferric-regulated protein B encoding genes (frpB) were constructed by allelic exchange. Both mutants carry in-frame mutations and no foreign DNA. Genotypically they were confirmed by PCR, Southern blot, and nucleotide sequence analysis. Gross genomic rearrangements were excluded by pulsed-field-gel electrophoresis. The phenotype was confirmed by an enzymatic assay (FrdA) or by separation of outer membrane proteins by SDS-PAGE (FrpB), and specificity of both mutants was confirmed by plasmid-based complementation in trans. The virulence of both mutants was investigated in an aerosol challenge experiment. It was shown that the FrdA mutant was significantly attenuated with respect to clinical symptoms and lung lesion score and, in addition, had a significantly reduced ability to persist in the lung. The FrpB mutant was completely attenuated and not longer able to colonize lungs or tonsils of the host. Therefore, both initial hypotheses could be confirmed. However, additional experiments will be required particular to investigate the molecular function of the FrpB protein which had an unexpectedly strong impact on the virulence of A. pleuropneumoniae.