Gene regulation in Actinobacillus pleuropneumoniae

Der Erreger der Porcinen Pleuropneumonie, Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist ein gram-negatives Bakterium, das für hohe wirtschaftliche Verluste in der industriellen Schweinehaltung verantwortlich ist. Zum besseren Verständnis der Erkrankung wurde die eisen- und sauerstoffabhängige Genregulation unter in vivo und in vitro Bedingungen weiter charakterisiert. Um Eisenmangel bedingte Effekte zu beobachten wurde ein A. pleuropneumoniae Markerstamm konstruiert, der das gfp (Grün fluoreszierendes Protein) Gen als Teil des tbp (Transferrin bindendes Protein) Operons auf dem Chromosom trägt. Uniforme GFP Expression konnte in vitro durch Eisenrestriktion induziert werden und die Insertion veränderte die Verwendung von Transferrin als Eisenquelle nicht. Die Virulenz des Stammes und die GFP Aktivität blieben in vivo erhalten. Allerdings konnte in infiziertem Gewebe eine FACS Sortierung und die Quantifizierung der fluoreszierenden Bakterien auf Grund starker Autofluoreszenz des homogenisierten Lungengewebes und des dadurch bedingten schlechten Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisses nicht quantitativ durchgeführt werden. Zur Untersuchung der Regulation des anaeroben Stoffwechsels in vivo wurden Außenmembranproteine ausgewählt, die von ArcA oder HlyX (dem FNR Homolog von A. pleuropneumoniae) reguliert werden. Diese Proteine wurden als potentielle Ziele für eine Immunhistologie-basierte Herangehensweise weiter untersucht und funktionell charakterisiert. Das FrpB Protein (“iron-regulated outer membrane protein B”) wurde als Repräsentant des HlyX Regulons ausgewählt. Es wurde gezeigt, dass FrpB trotz seines Namens unabhängig von der Regulation des globalen Regulators Fur (“ferric uptake regulator”) ist, und dass sich das Wachstum einer frpB Deletionsmutante unter anaeroben Bedingungen nicht von dem des Wildtyp–Stammes unterschied. Die histopathologische Untersuchung von Schweinelungen, die mit der A. pleuropneumoniae frpB Deletionsmutante infiziert waren bestätigte eine starke Attenuierung des Stammes. Eine funktionelle Auswertung ergab außerdem, dass die frpB Deletionsmutante nicht in der Lage ist porcines Transferrin zu verwenden; dieses ist jedoch die primäre Eisenquelle des Bakteriums in vivo. Das FrpB könnte somit das fehlende Bindeglied in der bakteriellen Eisenaufnahme von Transferrin-gebundenem Eisen sein. Polyklonale Seren gegen rekombinantes FrpB und gegen Bakterienmembranen wurden im Kaninchen hergestellt. Jedoch erkannte keines dieser Seren die Oberflächen-exponierten Epitope des FrpB Proteins. Das wäre jedoch die Grundvoraussetzung für eine anschließende Verwendung der Seren in der Immunhistochemie gewesen. Das Ape51 Protein, ein Homolog eines OmpA-ähnlichen, putativen Adhäsins in H. ducreyi wurde als Repräsentant des ArcA Regulons ausgewählt und in der Zweidimensionalen Polyacrylamid Gelelektrophorese bestätigt. Für die in vivo und in vitro Charakterisierung des Proteins wurde eine Deletionsmutante konstruiert und mittels PCR, Pulsfeldgelelektrophorese, Southern Blot und DNA Sequenzierung überprüft. Wachstums- und Überlebenskurven zeigten keine Unterschiede zwischen dem A. pleuropneumoniae Wildtyp und der ape51 Deletionsmutante. In einem Infektionsversuch zeigte sich die Mutante leicht, aber nicht statistisch signifikant attenuiert. Polyklonale Kaninchenseren gegen rekombinantes Ape51 erkannten Oberflächen-exponierte Epitope von Ape51 nicht spezifisch. Das wäre jedoch die Grundvoraussetzung für eine anschließende Verwendung der Seren in der Immunhistochemie gewesen.