Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Gene regulation in Actinobacillus pleuropneumoniae

Dreckmann, Karla

The causative agent of Porcine Pleuropneumonia, Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae, is a gram-negative bacterium responsible for high economical losses in the pig industry. To better understand the mechanisms of disease the iron- and anaerobiosis-dependent gene regulation was to be further characterised under in vivo and in vitro conditions. In order to monitor the effects of iron limitation an A. pleuropneumoniae GFP marker strain was constructed, carrying the gfp gene as part of the tbp operon on the chromosome. Uniform GFP expression was induced by iron restriction in vitro, the insertion did not alter the strain’s ability to use transferrin as a sole source of iron, virulence was maintained, and GFP-activity was stable in vivo. However, FACS sorting and quantification of fluorescent bacteria from the lung did not succeed due to a strong autofluorescence of homogenised lung tissue causing a high signal-to-noise ratio. In order to monitor the effects of anaerobiosis, outer membrane proteins regulated by ArcA and HlyX (the FNR homologue of A. pleuropneumoniae) were chosen as potential targets for an immunohistology-based approach and functionally investigated. The FrpB protein (iron-regulated outer membrane protein B) was chosen as a representative of the HlyX regulon. Despite its name FrpB expression was independent of the global ferric regulator Fur, and growth of the strain was not delayed under anaerobic conditions in comparison to the parent strain. Histopathology of lungs from pigs infected with an A. pleuropneumoniae frpB deletion confirmed the strong attenuation of the strain. Functional evaluation revealed that the A. pleuropneumoniae frpB deletion was unable to utilise porcine transferrin, the primary iron source of the bacterium and, therefore, the FrpB protein may be the “missing link” in the bacterial uptake of transferrin-bound iron. Polyclonal sera were raised in rabbits against both, recombinant FrpB protein and bacterial membranes; however, neither of the sera specifically recognized surface-exposed epitopes of the FrpB-protein which would have been a prerequisite for subsequent immunohistology. The Ape51 protein, a homologue to an OmpA-like putative adhesin in H. ducreyi, was chosen as a representative of the ArcA regulon and confirmed by 2 dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. For characterisation of the protein in vivo and in vitro an isogenic deletion mutant was constructed and confirmed by PCR, PFGE, Southern blot and nucleotide sequence analysis. Growth and survival and adhesion assays did not reveal differences between the A. pleuropneumoniae wt and the A. pleuropneumoniae ape51 deletion mutant. In an infection experiment the mutant was shown to be slightly but not significantly attenuated. Polyclonal sera were raised in rabbits against recombinant Ape51 protein but the serum did not recognise surface-exposed epitopes of the Ape51 protein which would have been a prerequisite for subsequent immunohistology.

Der Erreger der Porcinen Pleuropneumonie, Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist ein gram-negatives Bakterium, das für hohe wirtschaftliche Verluste in der industriellen Schweinehaltung verantwortlich ist. Zum besseren Verständnis der Erkrankung wurde die eisen- und sauerstoffabhängige Genregulation unter in vivo und in vitro Bedingungen weiter charakterisiert. Um Eisenmangel bedingte Effekte zu beobachten wurde ein A. pleuropneumoniae Markerstamm konstruiert, der das gfp (Grün fluoreszierendes Protein) Gen als Teil des tbp (Transferrin bindendes Protein) Operons auf dem Chromosom trägt. Uniforme GFP Expression konnte in vitro durch Eisenrestriktion induziert werden und die Insertion veränderte die Verwendung von Transferrin als Eisenquelle nicht. Die Virulenz des Stammes und die GFP Aktivität blieben in vivo erhalten. Allerdings konnte in infiziertem Gewebe eine FACS Sortierung und die Quantifizierung der fluoreszierenden Bakterien auf Grund starker Autofluoreszenz des homogenisierten Lungengewebes und des dadurch bedingten schlechten Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisses nicht quantitativ durchgeführt werden. Zur Untersuchung der Regulation des anaeroben Stoffwechsels in vivo wurden Außenmembranproteine ausgewählt, die von ArcA oder HlyX (dem FNR Homolog von A. pleuropneumoniae) reguliert werden. Diese Proteine wurden als potentielle Ziele für eine Immunhistologie-basierte Herangehensweise weiter untersucht und funktionell charakterisiert. Das FrpB Protein (“iron-regulated outer membrane protein B”) wurde als Repräsentant des HlyX Regulons ausgewählt. Es wurde gezeigt, dass FrpB trotz seines Namens unabhängig von der Regulation des globalen Regulators Fur (“ferric uptake regulator”) ist, und dass sich das Wachstum einer frpB Deletionsmutante unter anaeroben Bedingungen nicht von dem des Wildtyp–Stammes unterschied. Die histopathologische Untersuchung von Schweinelungen, die mit der A. pleuropneumoniae frpB Deletionsmutante infiziert waren bestätigte eine starke Attenuierung des Stammes. Eine funktionelle Auswertung ergab außerdem, dass die frpB Deletionsmutante nicht in der Lage ist porcines Transferrin zu verwenden; dieses ist jedoch die primäre Eisenquelle des Bakteriums in vivo. Das FrpB könnte somit das fehlende Bindeglied in der bakteriellen Eisenaufnahme von Transferrin-gebundenem Eisen sein. Polyklonale Seren gegen rekombinantes FrpB und gegen Bakterienmembranen wurden im Kaninchen hergestellt. Jedoch erkannte keines dieser Seren die Oberflächen-exponierten Epitope des FrpB Proteins. Das wäre jedoch die Grundvoraussetzung für eine anschließende Verwendung der Seren in der Immunhistochemie gewesen. Das Ape51 Protein, ein Homolog eines OmpA-ähnlichen, putativen Adhäsins in H. ducreyi wurde als Repräsentant des ArcA Regulons ausgewählt und in der Zweidimensionalen Polyacrylamid Gelelektrophorese bestätigt. Für die in vivo und in vitro Charakterisierung des Proteins wurde eine Deletionsmutante konstruiert und mittels PCR, Pulsfeldgelelektrophorese, Southern Blot und DNA Sequenzierung überprüft. Wachstums- und Überlebenskurven zeigten keine Unterschiede zwischen dem A. pleuropneumoniae Wildtyp und der ape51 Deletionsmutante. In einem Infektionsversuch zeigte sich die Mutante leicht, aber nicht statistisch signifikant attenuiert. Polyklonale Kaninchenseren gegen rekombinantes Ape51 erkannten Oberflächen-exponierte Epitope von Ape51 nicht spezifisch. Das wäre jedoch die Grundvoraussetzung für eine anschließende Verwendung der Seren in der Immunhistochemie gewesen.

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Dreckmann, Karla: Gene regulation in Actinobacillus pleuropneumoniae. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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