Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular genetic analysis of fertility traits in Hanoverian warmblood stallions

Giesecke, Katrin

The objective of this study was to identify genes with influence on stallion fertility in Hanoverian warmblood. We used the least square means and breeding values for the embryonic and paternal component of the pregnancy rate per oestrus for each stallion as fertility trait. For the estimation of the pregnancy rate per oestrus we used fertility data from the National state stud of Lower Saxony which were collected during the breeding seasons 1997 to 2005. These data included 199,000 artificial inseminations of 19,897 mares and 246 stallions and 96,114 oestrus cycles. In the case of an successful artificial insemination the trait value was encoded 1, otherwise the trait value was 0. For the prediction of breeding values we used an animal threshold model including the fixed environmental effects of insemination centre, age of stallion, breeding season, insemination month within breeding season, the number of inseminations within breeding season (covering number), time interval between coverings within an oestrus (insemination regime), breeding history of mares (previous breeding achievement of mares), the random permanent environmental effects of the mare and stallion and the random additive genetic effects of the stallion and the embryo. In order to detect genes responsible for fertility we searched previous reports for genes involved in the cascade of reproduction in horses and other mammals as well, notably in human and mice. We selected 36 genes as potential candidates, for which an influence on fertility function was known. For six of these candidate genes we perfomed an association analysis in Hanoverian warmblood stallions. First, we used the human mRNA sequences to determine the equine gene sequences, their location in the horse genome and the exon/intron boundaries. Then we sequenced intron-spanning regions of these genes which were considered to contain SNPs according to the SNP-tables of the Broad institute. In addition, we sequenced parts of the coding regions of three genes (ACE, SP17, SPATA1) and the whole coding region of one gene (FSHB) and searched these sequences for mutations. Detected mutations were tested for association with the fertility traits. For two of the seven genes (SPATA1, PRLR) we also performed cDNA-analyses using testis tissue of eight stallions in order to verify the annotated mRNA sequences and to find mutations with influence on the protein function. For three candidate genes, we also used five flanking microsatellites within a distance of at most one megabase (Mb) to the gene and tested them for association with the fertility traits. We performed single marker and haplotype analysis for the candidate genes. We found significantly associated SNPs in ACE, SPATA1 and INHBA using the least square means of the pregnancy rate per oestrus (LSM). Significantly associated SNPs were detected in SP17, SPATA1 and INHBA for the embryonic component of breeding values (BV-embryonic) and with the paternal component of breeding values (BV-paternal) significantly associated SNPs were shown in INHBA. Within sire families we found also significantly associated SNPs in ACE for the BV-embryonic and BV-paternal and in FSHB for the LSM. The haplotype analysis jointly for SP17, ACE and FSHB showed significantly assciated haplotypes with the LSM, the BV-embryonic and of SP17 also with the BV-paternal. INHBA-associated haplotypes were significant associated with all tested fertility traits. Our approach seems to be useful to identify significant associated genes with fertility in Hanoverian warmblood stallions. Significant associations should be approved by mutation analysis of the coding sequences of associated genes to detect causal mutations. In order to achieve this goal, testis tissues of a representative sample of stallions with wide differences in their PRO should be collected.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifikation von Genen, die einen Einfluss auf die Fruchtbarkeit bei Hannoveraner Warmbluthengsten besitzen. Im Rahmen der Assoziationsanalyse verwendeten wir kleinste Quadrat-Schätzwerte sowie embryonale und paternale Zuchtwerte der Trächtigkeitsrate pro Rosse und Hengst als Fruchtbarkeitsmerkmale. Die Berechnung der Trächtigkeitsrate pro Rosse und Hengst (TR) erfolgte anhand von Bedeckungsdaten aus dem Niedersächsischen Landgestüt Celle der Deckjahre 1997 bis 2005. Diese Daten enthielten 199.000 künstliche Besamungen von 246 Hengsten bei 19.897 Stuten in 96.114 Rossen. Bei Trächtigkeit innerhalb einer Rosse wurde der Merkmalswert mit 1 belegt, ansonsten mit 0. Für die Zuchtwertschätzung wurde ein Tiermodell mit einem Schwellenwertansatz verwendet, das die fixen Umwelteffekte der Deckstelle, des Alters der Hengste, der Zuchtsaison und der Zuchtperiode innerhalb der Zuchtsaison, die Anzahl der Bedeckungen und der Abstand zwischen den Bedeckungen innerhalb einer Rosse, die bisherige Zuchtleistung der Stuten und die zufälligen permanenten Umwelteffekte der Stute und des Hengstes sowie den zufälligen additiv-genetischen Effekt des Hengstes und des Embryos enthielt. Es wurden 36 potentielle Kandidatengene anhand der Ergebnisse früherer Studien über die Reproduktionskaskade beeinflussende Gene bei Pferden und anderen Säugetieren, vor allem dem Menschen und Mäusen, ausgewählt. Für sechs dieser Kandidatengene wurde die Assoziation mit Fruchtbarkeitsmerkmalen bei Hannoveraner Hengsten berechnet. Für die Suche nach Gen-assoziierten Mutationen wurden die humanen mRNA-Sequenzen der Kandidatengene als Referenzen verwendet. Wir sequenzierten Intron-übergreifende Bereiche, die Einzelbasenaustausche (single nucleotide polymorphisms, SNPs) entsprechend der SNP-Tabellen des Broad Instituts enthielten. Außerdem wurden Teile des kodierenden Bereichs von drei Genen (ACE, SP17, SPATA1) sowie die gesamte kodierende Sequenz eines Gens (FSHB) sequenziert und auf das Vorhandensein von Mutationen untersucht. Für die jeweils gefundenen Polymorphismen wurden Assoziationsanalysen mit Fruchtbarkeitsmerkmalen durchgeführt. Zur Überprüfung der annotierten Sequenzen und zur Suche nach alternativen Splice-Varianten und Mutationen mit Einfluss auf die Proteinfunktion wurde bei zwei Genen (SPATA1, PRLR) eine cDNA-Analyse anhand von RNA aus Hodengewebe acht verschiedener Hengste durchgeführt. Im Rahmen der Assoziationsanalyse verwendeten wir bei drei Kandidatengenen zusätzlich zu den intragenischen SNPs Gen-flankierende Mikrosatelliten mit einem maximalen Abstand von einer Megabase zum jeweiligen Gen. Es wurden Assoziationsanalysen einzelner Marker und von Haplotypen für die Kandidatengene durchgeführt. Bei ACE, SPATA1 und INHBA fanden wir signifikant mit den kleinsten Quadrat-Schätzwerten der TR assoziierte SNPs. Mit dem embryonalen Zuchtwert der TR signifikant assoziierte SNPs wurden bei SP17, SPATA1 und INHBA gefunden und mit dem paternalen Zuchtwert der TR signifikant assoziierte SNPs wurden bei INHBA entdeckt. Im Rahmen von Halbgeschwisteranalysen wurden bei ACE mit dem paternalen und embryonalen Zuchtwert und bei FSHB mit den kleinsten Quadrat-Schätzwerten der TR signifikant assoziierte SNPs gefunden. Die gemeinsame Haplotypenanalyse von SP17, ACE und FSHB ergab mit den kleinsten Quadrat-Schätzwerten und den embryonalen Zuchtwerten signifikant assoziierte Haplotypen. Bei SP17 wurden außerdem mit dem paternalen Zuchtwert assoziierte Haplotypen entdeckt. INHBA-assoziierte Haplotypen waren mit allen getesteten Fruchtbarkeitsparametern signifikant assoziiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die ausgewählte Methode gut geeignet ist, um signifikant mit Fruchtbarkeit assoziierte Gene bei Hannoveraner Hengsten zu identifizieren. In Zukunft sollten bei signifikant assoziierten Genen Mutationsanalysen der kodierenden Sequenz zur Aufdeckung kausaler Mutationen durchgeführt werden. Für weitere Analysen sollte Hodengewebe einer repräsentativen Anzahl an Hengsten mit entsprechend großen Unterschieden in ihrer Trächtigkeitsrate pro Rosse entnommen werden.

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Giesecke, Katrin: Molecular genetic analysis of fertility traits in Hanoverian warmblood stallions. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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