Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR in Kotproben von Schweinen

Lawsonia (L.) intracellularis ist der Erreger der proliferativen Enteropathie beim Schwein. Diese Darmerkrankung ist weltweit verbreitet und tritt in verschiedenen Verlaufsformen auf. Der Nachweis einer Infektion mit L. intracellularis erfolgt intra vitam indirekt mittels blutserologischer Verfahren und/oder durch den direkten Erregernachweis mittels PCR resp. IFT an Kotproben. Die derzeit verfügbaren Methoden zum direkten Nachweis bieten allerdings nicht die Möglichkeit, zwischen einer natürlichen Infektion mit dem Wildtyp und einem möglichen Nachweis des Impfstammes zu unterscheiden. Darüber hinaus kann anhand der Ergebnisse einer qualitativen PCR lediglich eine qualitative Bewertung (ja/nein) aber keine quantitative Aussage zu Erregermenge getroffen werden. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, eine sensitive und hochspezifische Nachweismethode zu entwickeln und zu validieren, die eine Quantifizierung des Gehaltes spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kotproben von Schweinen zulässt. Darüber hinaus wurden mögliche Einflüsse der Dauer und der Temperatur während einer Probenlagerung auf den Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis überprüft. Die Verteilung des Erregers in Kotproben und ein Einfluss der Verfahren zur Homogenisierung von Probenmaterial wurden ebenfalls untersucht. Die real-time PCR wurde in Anlehnung an nationale und internationale Richtlinien umfassend validiert. Die analytische Spezifität der Primer und der Sonde wurde an verschiedenen Erregerspezies überprüft, die in Kotproben vom Schwein in bedeutender Menge vorkommen können. In diesen Untersuchungen traten keine „falsch positiven“ Resultate auf. Die Nukleotidsequenz der PCR-Produkte ergab eine 100 %ige Übereinstimmung mit einem Sequenzabschnitt des Typstammes von L. intracellularis. Ein Standard zur Quantifizierung mittels der ΔΔCt-Methode war aus Plasmiden hergestellt worden, die als Insert eine das PCR Produkt enthaltende Sequenz von L. intracellularis trugen. Eine Verdünnungsreihe dieser Plasmide wurde auch zur Erstellung der Standardkurve verwendet. Die Steigung dieser Standardkurve resp. -gerade beträgt –3,329, was einer Effizienz der real-time PCR von 99,7 % entspricht. Der Kalibrationsbereich umfasst Konzentrationsstufen von 100 bis 107 GE / µl Reaktionseinheit. Die untere Nachweisgrenze der real-time PCR beträgt 1 GE im Reaktionsvolumen; die obere Nachweisgrenze ist 108 GE / µl Reaktionsvolumen. Eine absolute Quantifizierung ist im Bereich von 101 bis 107 GE / µl Reaktionsvolumen möglich. Die Präzision wurde in Wiederhol- und in Vergleichsuntersuchungen bestimmt und konnte für alle Konzentrationsstufen im Kalibrationsbereich bestätigt werden (relative Standardabweichung ≤ 15 % resp. ≤ 20 %, Grenzwert 30%). Die Erkennung einer möglichen Inhibition der PCR Reaktion wird durch eine interne Positivkontrolle gewährleistet. Ein möglicher Einfluss der Amplifikation dieser Kontrolle auf die Quantifizierung wurde geprüft und ausgeschlossen. Die Probenaufbereitung und Isolierung von DNA mit dem QIAamp® DNA Stool Mini Kit sind demnach geeignet, Inhibitoren sicher aus der Probenmatrix zu entfernen. Die Wiederfindungsrate für target-DNA von L. intracellularis in Kotproben betrug zwischen 1,8 % und 3,5 %. In einer vergleichenden Untersuchung an 300 Kotproben, die zuvor mittels multiplex-PCR zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis charakterisiert wurden, konnte die Nachweisrate von 50 % auf 81,7 % erhöht werden. Aus diesen Ergebnissen wird abgeleitet, dass die real-time PCR deutlich sensitiver  als die multiplex-PCR ist. Der Test zeichnet sich durch eine hohe Robustheit aus und ist für die Routinediagnostik geeignet. Die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben ist ausreichend homogen, wenn die Probe unmittelbar vor der Untersuchung manuell durchmischt wird. Die Zugabe von Flüssigkeit zum Probenmaterial, um dessen Viskosität herabzusetzen und so eine bessere Verteilung zu erreichen, hatte lediglich einen Verdünnungseffekt bei gleichbleibender Homogenität zur Folge. Der Einfluss einer Lagerung von Proben auf den Gehalt spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis wurde für verschiedene Temperaturen (6 °C, -20 °C und -70 °C) und unterschiedliche Lagerdauer überprüft. Der Gehalt von L. intracellularis war unabhängig von der Temperatur bis zum Ende der Untersuchung (Tag 132) konstant.