Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR in Kotproben von Schweinen

Holthaus, Kerstin

Lawsonia (L.) intracellularis is the etiologic agent of proliferative enteropathy in swine. This intestinal disease is common worldwide and occurs in different forms. The infection with L. intracellularis is verified intra vitam either indirectly via serology and/or directly via the detection of the causative organism by PCR resp. IFA in faecal samples. However, current available methods of direct detection do not offer the possibility of distinguishing between a natural infection with the wild type and an active immunization. Furthermore, the results of a qualitative PCR can only distinguish between „yes“ or „no“, i.e. if the animal is infected or not. No evidence is gained about the amount of L. intracellularis within the sample. The aim of this study was to develop and to validate a sensitive and highly specific detection method, which allows the quantification of the amount of L. intracellularis in porcine faecal samples. Additionally, the possible influences of storage temperature and duration on the sample as to the detection of L. intracellularis were tested. The distribution of the agent in faecal samples and the influence of the method of sample homogenization were also analysed. This real-time PCR was validated comprehensively according to national and international guidelines. The analytical specificity of primer and probe was tested on several bacterial strains, all of which can occur in porcine faecal samples in significant quantities. In this study no „false positive“-results could be detected. Sequences of PCR-products agree with the sequence of the type strain of L. intracellularis to 100%. A standard, used for quantification by ΔΔCt-method, was made from plasmids which included the PCR-product containing sequence from L. intracellularis. A dilution series of these plasmids was also employed to establish the standard curve. The slope of the standard curve was -3,329. The efficiency of the real-time PCR therefore is 99,7%. The range contains concentration stages from 100 to 107 genome equivalents / µl reaction unit. The lower detection limit of the real-time PCR is 1 genome equivalent per reaction volume; the upper detection limit is 108 genome equivalents / µl reaction volume. An absolute quantification is possible within the range of 101 to 107 genome equivalents / µl reaction volume. The precision was determined as repeatability and intermediate precision and was confirmed for all concentration stages of the range (relative standard deviation ≤ 15% and ≤ 20%, respectively, limit 30%). The identification of a possible inhibition of the PCR reaction is ensured by an internal amplification control. A possible influence of the amplification of this control on the quantification was tested and excluded. The use of the QIAamp® DNA Stool Mini Kit for sample preparation and isolation of DNA is thus suitable for ensuring the deletion of inhibitors from sample matrix. The recovery of genome equivalents from L. intracellularis in faecal samples amounted between 1,8% and 3,5%. In a comparative study of 300 faecal samples, which were characterized previously by multiplex-PCR to detect specific target-DNA of L. intracellularis, the detection rate was increased from 50% to 81,7 %. According to these results, the real-time PCR is considerably more sensitive than multiplex-PCR. The test stands out due to a high robustness and is suitable for routine diagnostics. The distribution of L. intracellularis in faecal samples is homogenous, if the sample is stirred manually immediately prior to the initialisation of the test. The addition of a liquid to the sample in order to decrease viscosity and thereby achieve a better distribution, merely lead to a dilution of the sample. The influence of the sample storage on the content of specific genome fragments of L. intracellularis was examined at different temperatures (6 °C, -20 °C and -70 °C) and duration periods. The content was constant independently of the temperature until end of the examination (day 132), measured in GE by L. intracellularis.

Lawsonia (L.) intracellularis ist der Erreger der proliferativen Enteropathie beim Schwein. Diese Darmerkrankung ist weltweit verbreitet und tritt in verschiedenen Verlaufsformen auf. Der Nachweis einer Infektion mit L. intracellularis erfolgt intra vitam indirekt mittels blutserologischer Verfahren und/oder durch den direkten Erregernachweis mittels PCR resp. IFT an Kotproben. Die derzeit verfügbaren Methoden zum direkten Nachweis bieten allerdings nicht die Möglichkeit, zwischen einer natürlichen Infektion mit dem Wildtyp und einem möglichen Nachweis des Impfstammes zu unterscheiden. Darüber hinaus kann anhand der Ergebnisse einer qualitativen PCR lediglich eine qualitative Bewertung (ja/nein) aber keine quantitative Aussage zu Erregermenge getroffen werden. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, eine sensitive und hochspezifische Nachweismethode zu entwickeln und zu validieren, die eine Quantifizierung des Gehaltes spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kotproben von Schweinen zulässt. Darüber hinaus wurden mögliche Einflüsse der Dauer und der Temperatur während einer Probenlagerung auf den Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis überprüft. Die Verteilung des Erregers in Kotproben und ein Einfluss der Verfahren zur Homogenisierung von Probenmaterial wurden ebenfalls untersucht. Die real-time PCR wurde in Anlehnung an nationale und internationale Richtlinien umfassend validiert. Die analytische Spezifität der Primer und der Sonde wurde an verschiedenen Erregerspezies überprüft, die in Kotproben vom Schwein in bedeutender Menge vorkommen können. In diesen Untersuchungen traten keine „falsch positiven“ Resultate auf. Die Nukleotidsequenz der PCR-Produkte ergab eine 100 %ige Übereinstimmung mit einem Sequenzabschnitt des Typstammes von L. intracellularis. Ein Standard zur Quantifizierung mittels der ΔΔCt-Methode war aus Plasmiden hergestellt worden, die als Insert eine das PCR Produkt enthaltende Sequenz von L. intracellularis trugen. Eine Verdünnungsreihe dieser Plasmide wurde auch zur Erstellung der Standardkurve verwendet. Die Steigung dieser Standardkurve resp. -gerade beträgt –3,329, was einer Effizienz der real-time PCR von 99,7 % entspricht. Der Kalibrationsbereich umfasst Konzentrationsstufen von 100 bis 107 GE / µl Reaktionseinheit. Die untere Nachweisgrenze der real-time PCR beträgt 1 GE im Reaktionsvolumen; die obere Nachweisgrenze ist 108 GE / µl Reaktionsvolumen. Eine absolute Quantifizierung ist im Bereich von 101 bis 107 GE / µl Reaktionsvolumen möglich. Die Präzision wurde in Wiederhol- und in Vergleichsuntersuchungen bestimmt und konnte für alle Konzentrationsstufen im Kalibrationsbereich bestätigt werden (relative Standardabweichung ≤ 15 % resp. ≤ 20 %, Grenzwert 30%). Die Erkennung einer möglichen Inhibition der PCR Reaktion wird durch eine interne Positivkontrolle gewährleistet. Ein möglicher Einfluss der Amplifikation dieser Kontrolle auf die Quantifizierung wurde geprüft und ausgeschlossen. Die Probenaufbereitung und Isolierung von DNA mit dem QIAamp® DNA Stool Mini Kit sind demnach geeignet, Inhibitoren sicher aus der Probenmatrix zu entfernen. Die Wiederfindungsrate für target-DNA von L. intracellularis in Kotproben betrug zwischen 1,8 % und 3,5 %. In einer vergleichenden Untersuchung an 300 Kotproben, die zuvor mittels multiplex-PCR zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis charakterisiert wurden, konnte die Nachweisrate von 50 % auf 81,7 % erhöht werden. Aus diesen Ergebnissen wird abgeleitet, dass die real-time PCR deutlich sensitiver  als die multiplex-PCR ist. Der Test zeichnet sich durch eine hohe Robustheit aus und ist für die Routinediagnostik geeignet. Die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben ist ausreichend homogen, wenn die Probe unmittelbar vor der Untersuchung manuell durchmischt wird. Die Zugabe von Flüssigkeit zum Probenmaterial, um dessen Viskosität herabzusetzen und so eine bessere Verteilung zu erreichen, hatte lediglich einen Verdünnungseffekt bei gleichbleibender Homogenität zur Folge. Der Einfluss einer Lagerung von Proben auf den Gehalt spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis wurde für verschiedene Temperaturen (6 °C, -20 °C und -70 °C) und unterschiedliche Lagerdauer überprüft. Der Gehalt von L. intracellularis war unabhängig von der Temperatur bis zum Ende der Untersuchung (Tag 132) konstant.

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Holthaus, Kerstin: Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR in Kotproben von Schweinen. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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