Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Detailed analysis of immunoprivileged tissues in skin appendages

Meyer, Katja Christina

Recent gene profiling data in mice have raised the possibility, that follicular IP is not only limited to the anagen hair bulb, but that the epithelial stem cell region in the ORS of HFs, termed the bulge, may also represent an area of relative IP. Since protection of these epithelial stem cells from immune destruction is essential for preserving the regenerative and cycling capacity of the follicle, it seems logical that the bulge region should also have an established relative IP. The current study on the immune status of human HFs and murine sinus hair follicles and nail apparatus, is based on both routine and increased-sensitivity immunohistochemical (including Immunofluorescence) staining techniques, and evaluation of these IR patterns by quantitative immunohistochemistry, histochemical and histomorphometric assessments. Additionally, full thickness human scalp skin organ culture and the HF organ culture model were used for functional evidence. The in situ protein expression data presented here provide evidence, that the bulge region of anagen VI HFs meets all criteria of an IP site, and suggests that the bulge has a perhaps stronger immune protection than that of the anagen bulb. Contrary to previous reports, we demonstrated that MHC class Ia, β2-microglobulin and MHC class II IR were down-regulated in the human bulge relative to the distal ORS. The locally secreted immunosuppressants α- MSH and TGF-β were prominently expressed in the bulge. In addition, IDO and MIF showed higher IR levels around the bulge compared to the proximal follicle and CD200 and HLA-E were solely expressed in the stem cell-rich bulge region. Besides these systematic bulge immuno phenotyping experiments, we obtained functional evidence for an established IP in the bulge, by showing that IFN-γ can induces significant ectopic MHC class Ia expression in bulge cells of organ-cultured human scalp skin, as it had been shown for the anagen hair bulb. However, our results also revealed that the bulge and bulb IP in human scalp HFs differ in several important aspects: The level of constitutive MHC I, MHC II and β2-microglobulin IR was not as low as in the hair bulb, which may indicate that the bulge IP is constitutively more prone to inciting an immune response than the bulb, resulting in an inflammatory cell attack on bulge epithelial stem cells. This thesis also contributes considerably towards the immunological characterization of the murine vibrissal follicle and murine nail apparatus, and showed that the vibrissal bulb, and to a lesser extent, the bulge as well as the proximal nail matrix can also be considered to be sites of relative IP. Both tissues showed a substantial downregulation of MHC class I and II in the examined IP sites. Prominent IR of the immunosuppressant TGF-β1 was demonstrated in the PNM, bulge and weaker in the bulb, exerting also an important role in IP. Furthermore, the presented distribution pattern of CD4+ and CD8+ T cells was similar to the human HF. Besides these IP-associated findings, we could observe that mast cell numbers decreased in vibrissal follicles towards the vibrissal bulb, whereas no relevant differences in the distribution could be shown in the murine nail apparatus. In addition, we identified ICAM-1+ positive cells to be limited to the mesenchyme of the nail apparatus. The number of these cells was slightly reduced in the vicinity of the PNM and the foot pad, but no intraepithelial clusters were observed, in accordance with previous studies on the human nail apparatus. Unexpected results were obtained for β-defensin 2, showing substantially higher levels of IR in the PNM and in the entire ORS of the vibrissal follicle, and only weak IR in epidermal layers. Nonetheless, whether mast cells, ICAM-1, and β-defensin 2 contribute to the mechanisms for or against IP, remains to be further explored. The analyses of this study were concluded by exploring the effects of the α-MSH related tripeptide K(D)PT by using an organ-culture HF model. K(D)PT failed to act as a protection or restoration agent of IP. However, K(D)PT counteracted IFN-γ-induced upregulation of mast cell numbers and degranulation. In addition, we demonstrated that K(D)PT inhibited inflammation-induced premature catagen development, whereas it did not considerably influence hair shaft formation in vitro or stimulate the proliferation of hair matrix keratinocytes. In summary, the current thesis has provided evidence for a second epithelial IP within the human HF, which could even be stronger than that of the bulge. Moreover, the presented results indicate that the murine PNM, and the bulge and bulb of vibrissal follicles also enjoy IP, so that some gaps in basic immunological research could be filled. This was complemented with the exploration of the new candidate K(D)PT for IP-restoration or protection and the demonstration of several effects, which may involve that K(D)PT may be used pharmacologically as a hair growth modulator.

Neueste Daten auf Genebene von Mäusen haben die Vermutung nahegelegt, dass nicht nur die anagene Haarwurzel zum follikulären Immunprivileg (IP) zählt, sondern auch die sogenannte Wulstregion in der äußeren Wurzelscheide des Haarfollikels, die dessen epitheliale Stammzellregion darstellt. Methodische Grundlagen für die vorliegende Studie an Haarfollikeln des Menschen und an Sinushaarfollikeln und dem Nagelapparat der Maus waren primär hochspezifische immunhistochemische Färbungen (inklusive Immunfluoreszenz), die qualitativ und quantitativ ausgewertet wurden. Weiterhin wurden für die Erarbeitung funktioneller Daten Vollhautorgankulturen von humanen Kopfhautproben sowie Kulturen mit mikrodissezierten humanen Haarfollikeln verwendet. Die hier präsentierten in situ Protein Reaktivitätsverteilungsmuster erbringen den Beweis, dass die Wulstregion des Anagen VI Haarfollikels alle Kriterien eines immunprivilegierten Gewebes erfüllt. Sie lassen sogar vermuten, dass die Wulstregion einen stärkeren Immunschutz aufweist als die anagene Haarwurzel. Im Gegensatz zu früheren Veröffentlichungen zeigen wir in unserer Arbeit, dass die Immunreaktivität von MHC Klasse Ia, β2-Mikroglobulin und MHC Klasse II Molekülen in der Wulstregion, verglichen mit der distalen äußeren Wurzelscheide, stark herabgesetzt ist. Die lokal sezernierten Immunosuppressoren α-MSH und TGF-β waren ebenfalls in der Wulstregion prominent. Zusätzlich zeigten IDO und MIF höhere Immunintensitäten im Bereich der Wulstregion als im proximalen Haarfollikel und die Moleküle CD200 und HLA-E waren alleinig in der stammzellreichen Wulstregion vertreten. Neben dieser systematischen, immunphänotypischen Analyse, konnten wir zusätzlich einen funktionellen Beweis für das Bestehen eines IP in der Wulstregion erbringen: Ähnlich den Beobachtungen vorheriger Experimente an der immunprivilegierten anagenen Haarwurzel, konnten wir demonstrieren, dass eine Behandlung mit IFN-γ in organ-kultivierten humanen Skalp-Vollhautstanzen eine Hochregulation von MHC Klasse Ia IR in der Wulstregion bewirkte. Gleichzeitig zeigen die Ergebnisse jedoch auch, dass sich die Wulstregion und die anagene Haarwurzel hinsichtlich verschiedener Aspekte unterscheiden: Die Intensitätsstärke von MHC Klasse I, Klasse II und β2-Mikroglobulin ist in der Wulstregion höher als in der Haarwurzel, was darauf hin deutet, dass das IP der Wulstregion unmittelbarer eine Immunreaktion zulässt als die Haarwurzel und die Folge eine entzündliche Zellattacke auf die epithelialen Stammzellen in der Wulstregion und Zerstörung sein könnte. Mit dieser Arbeit wurde auch ein Beitrag zur immunologischen Charakterisierung von Sinushaarfollikel und dem Nagelapparat der Maus geleistet. Es konnte gezeigt werden, dass die Haarwurzel des Sinushaarfollikels, und zu einem geringeren Maße dessen Wulstregion sowie die proximale Nagelmatrix, ebenfalls zu immunologisch privilegierten Regionen zählen. Beide Gewebetypen in den genannten Regionen wiesen eine stark reduzierte Färbungsintensität für MHC Klasse I und II Moleküle auf. Ferner war TGF-β1 stark präsent in der proximalen Nagelmatrix, in der Wulstregion und, weniger intensiv, in der Haarwurzel, so dass eine wichtige Funktion für diese Substanz zu unterstellen ist. Das Verteilungsmuster von CD4+ und CD8+ T Zellen war ebenfalls ähnlich den Verhältnissen im humanen Haarfollikel. Neben diesen IP-assoziierten Ergebnissen konnten wir zeigen, dass die Zahl an Mastzellen innerhalb des Sinushaarfollikels von der Epidermis zur Haarwurzel kontinuierlich abnimmt, wohingegen kein relevanter Unterschied im Verteilungsmuster innerhalb des Maus-Nagelapparates zu verzeichnen war. Zusätzlich wurden ICAM-1 positive Zellen identifiziert, die auf das Mesenchym des Nagelapparates begrenzt waren. In direkter Nähe zur proximalen Nagelmatrix und zum Fußballen waren etwas weniger ICAM-1+ Zellen zu beobachten. Intraepitheliale Anhäufungen dieser Zellen wurden, entgegen vorheriger Berichte, im humanen Nagelsystem nicht gefunden. Unerwartete Resultate wurden ebenfalls für β-Defensin 2 erhoben, da die proximale Nagelmatrix und die gesamte ORS des Sinushaarfollikels substantiell höhere Reaktionsintensitäten aufwiesen, als in den epidermalen Zellschichten. Ob und welche Rolle Mastzellen, ICAM-1+ Zellen und das antimikrobielle Peptid β-Defensin 2 zur Erhaltung des IP spielen, sollte in zukünftigen Versuchen weiter erforscht werden. Die Analysen dieser Studie wurden ergänzt mit der Erforschung von K(D)PT hinsichtlich seiner Effekte auf den Haarfollikel durch den Einsatz unseres HF-Organ-Kulturmodels. Diese Substanz, ein neues synthetisches, mit α-MSH verwandtes Tripeptid, war jedoch als Wirkstoff zur Protektion oder Wiederherstellung des IP nicht überzeugend. Wir konnten allerdings demonstrieren, dass K(D)PT der IFN-γ induzierten Zunahme von Mastzellen und der Rate an Degranulation entgegenwirkte; zusätzlich inhibierte K(D)PT die entzündungsinduzierte vorzeitige Catagenentwicklung. Zusammenfassend gesehen, erbringt die vorliegende Dissertation den Beweis, dass die Wulstregion ein zweites epitheliales IP innerhalb des HFs darstellt. Dieses IP ist möglicherweise stärker oder bedeutender, als dasjenige der Haarwurzel. Zusätzlich weisen die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass die murine PNM des Nagelapparates, sowie die Wulstregion und Haarwurzel des Sinushaarfollikels ebenfalls immunologisch privilegiert sein könnten; zudem war es möglich, einige Lücken in der immunologischen Grundlagenforschung zu schließen. Ergänzt wurde diese Studie durch die Erforschung eines neuen Haarmodulator-Kandidatens, dem K(D)PT, das zwar nicht als IP-Modulator einzusetzen ist, jedoch zur Behandlung von Haarausfall und gegen Vergrauung genutzt werden könnte.

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Meyer, Katja Christina: Detailed analysis of immunoprivileged tissues in skin appendages. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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