Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Einfluss von Chemokinen und Tumor Nekrose Faktor-α auf die Funktion des Corpus luteum beim Rind während des Diöstrus, der Trächtigkeit und der Luteolyse

Raddatz, Sybille

The decline of successful pregnancy rates in high performance holstein-friesian dairy cattle could be the result of ovarian dysfunctions, which are caused by inflammations like the masti-tis. The influence of inflammation-mediated leucocytes, chemokines und cytokines on the corpus luteum (CL) is only partially known. Therefore the aim of the present study was a comparative investigation on the incidence of leucocytes, chemokines und TNF-α at the CL cyclicum and CL graviditatis. Additionally a possible modulation of the luteal chemokine- and TNF-α gene expression as well as the P4-synthesis by PGF2α and TNF-α was proved. For this purpose the gene expression of the chemokines CCL5, CCL20, CXCL1, CXCL8 and of the cytokine TNF-α in CL-tissue have been determined by qRT-PCR considering local differences (CL-periphery versus CL-centre) in three types of experimental models. In the first step ovaries with CL of the mid-luteal phase were obtained from 7 pregnant and 8 cyclic, fresh slaughtered cattle. In addition to qRT-PCR the rate of migration of eosinophil and neu-trophil granulocytes were functionally proved with supernatants of CL-tissue fragments. Fur-thermore the concentrations of P4 in supernatants of CL-tissue fragments were detected. In addition, the presence and quantity of resident leucocytes und eosinophils were determined in histological CL-slices. The gene expression of the tested chemokines and TNF-α were demonstrated in all CL in the centre. Only in the periphery of one CL cyclicum no expression of CCL20 and CXCL8 could be verified. No differences in gene expression between CL graviditatis and CL cyclica ex-isted. In the CL-centre the gene expression of CXCL8, CCL20 and CLL5 were significantly higher compared to the CL-periphery, whereas the gene expression of TNF-α was signifi-cantly higher in the periphery. The lack of differences between CL cyclica and CL graviditatis suggest comparable immuno-regulatory processes in physiologically different corpora lutea. The locally different gene ex-pression of chemokines and TNF-α, as well as differences in P4-concentration in CL-supernatants of centre and periphery could indicate differences in blood flow and immu-noregulatory mechanism inside the CL. A significant higher migration rate of neutrophil granulocytes (53%) after incubation with CL-tissue supernatants (compare to medium-controls: 24%-30%) documented the functional expression of chemotactic mediators in the CL. This fact seems only to be relevant for neu-trophil granulocytes, because no significant influence of the in-vitro-migration was observed for eosinophils. The secretion of neutrophil chemoattractive substances did not differ in CL-periphery and CL-centre, as well as CL cyclica and CL graviditatis. This observation is con-firmed by the constant number of leucocytes in CL cyclica and CL graviditatis, as well as in CL-periphery and CL-centre, detected by immunohistochemical staining. The very low num-ber of eosinophils (0-1 ± 0,4) compared to the quantity of leucocytes in CL-slices were cor-roborated by a significant negative correlation (r = -0,76) between the eosinophil migration rate and the expression of TNF-α in the periphery. In the second part of this study the gene expression were determined during luteolysis in CL from healthy, normally cycling heifers on day 10 until 12 post ovulationem (p.ov.). Therefore the ovaries of 24 heifers were excised by transvaginal ovariectomy 5 min, 15 min, 30 min, 120 min and 720 min after injection of 25 mg of the PGF2α analogue dinoprost. From 5 heifers ovaries were obtained without a previous PGF2α injection. A significant increase in gene ex-pression of CCL20 was detected 720 min post injectionem (p.i.) in the CL-centre compared to the control. The gene expression of CXCL1 was significant higher in the CL-periphery and in the CL-centre 15 min p.i. until the end of the investigation (720 min p.i.) compared to the control group. For CXCL8 an significantly increased gene expression in the CL-centre could be detected already after 15 min, whereas in the CL-periphery the gene expression rised not until 30 min p.i., in both locations expression remained significantly higher until 120in p.i.. The gene expression of TNF-α was significantly higher in the CL-centre and in the CL-periphery 15 min and 30 min after PGF2α injection compared to the control group; this aug-mentation was still observed 120 min p.i. in the CL-centre. The expression of CCL5 after PGF2α injection was higher until the end of investigation compared to the control group, how-ever this result was not significant. The P4-plasma concentration of PGF2α treated heifers de-creased significantly 720 min p.i., compared to the control animals. Therefore the PGF2α-injection affected the expression pattern of chemokines and TNF-α in the CL. This result in-dicates an involvement of these substances in bovine luteolysis. In the third part the influence of PGF2α on the gene expression in vitro were investigated in CL-fragments. Furthermore the influence on the gene expression in CL-fragments was tested by the exogenous application of an inflammatory mediator (TNF-α). These studies were con-ducted with CL cyclica in the mid-luteal phase from fresh slaughtered cattle. Prostaglandin F2α induced no significant alterations in gene expression in the culture of CL-tissue and did not affect the concentration of P4 in supernatants of CL-tissue. By contrast incubation of CL-tissue with TNF-α led to a significant elevated expression of CXCL1, CXCL8 and TNF-α in the CL-periphery. Likewise the expression of CXCL8 was also higher in the CL-centre com-pared to CL-tissue without TNF-α-application. All chemokines and TNF-α in CL cyclica of fresh slaughtered cattle were expressed in a higher amount, compared to CL on day 10 until 12 p.ov.. Significant differences were ob-served for CCL5, CCL20, CXCL1 and TNF-α. This was noticed for CCL20 and CXCL1 in the CL-periphery and in the CL-centre, as well as in CCL5 in the CL-centre and in TNF-α in the CL-periphery. For this reason in-vitro-models are only suitable to a limited extend to de-termine the modulation of chemokine and TNF-α gene expression. In addition these elevated expressions in CL of slaughtered cattle suggest an inducement of the luteal chemokine and TNF-α gene expression by inflammation and/or stress. The results of the present study described for the first time the gene expression of the chemokines CXCL1, CXCL8 and CCL20 during the mid luteal phase in CL cyclium and Cl graviditatis in cattle. In addition this study shows strong correlations between a PGF2α–induced luteolysis and an increased expression of these chemokines and TNF-α in vivo. The missing influence of PGF2α on the gene expression in vitro suggest that in vivo PGF2α does not directly influence luteolysis but rather acts indirectly via other mediators, like TNF- α. Further studies about the luteolytic influence of PGF2α in vivo should focus on the question how this substance modifies gene expression in bovine corpus luteum. Additionally the impact of dif-ferent, in local and systemic inflammations up regulated mediators should be investigated in CL-physiology. In conclusion the knowledge about the influence of immunological processes on reproduction should be expended to enhance fertility in dairy cattle in future.

Eine in den letzten Jahrzehnten sinkende Trächtigkeitsrate des Hochleistungsmilchrindes der Rasse Holstein-Friesian könnte ihre Ursache in einer Dysfunktion der Ovarphysiologie haben, welche durch Entzündungen wie der Mastitis ausgelöst werden kann. Der Einfluss von Entzündungsvermittelnden Leukozyten, Chemokinen und Zytokinen auf das Corpus luteum (CL) ist jedoch nur teilweise erforscht. Ziel dieser Studie war es, das Vorkommen von Leuko-zyten, Chemokinen und TNF-α im CL cyclicum und CL graviditatis vergleichend zu analysie-ren. Zusätzlich wurde geprüft, in wieweit eine Modulation der lutealen Chemokin- und TNF-α- Genexpression, sowie der P4-Synthese durch PGF2α und TNF-α erfolgt. Hierfür wurde die Genexpression der Chemokine CCL5, CCL20, CXCL1, CXCL8 und des Zytokins TNF-α unter Beachtung möglicher regionaler Unterschiede (CL-Peripherie versus CL-Zentrum) im CL-Gewebe mittels qRT-PCR in drei Versuchsmodellen bestimmt. Im ers-ten Abschnitt wurden in der Blütephase befindende, CL-tragende Ovarien von 7 trächtigen und 8 zyklischen, frisch geschlachteten Rindern entnommen. Zusätzlich zur qRT-PCR wurde funktionell geprüft, ob die Kulturüberstände von CL-Gewebefragmenten zur Migration von Eosinophilen und Neutrophilen führen. Außerdem wurde die P4-Sekretion in CL-Gewebekulturüberständen nachgewiesen. Des Weiteren erfolgte die Untersuchung auf das Vorkommen und die Zahl residenter Leukozyten und eosinophiler Granulozyten in histologischen CL-Gewebeschnitten. Eine Expression der untersuchten Chemokine und TNF-α konnte in allen CL im CL-Zentrum nachgewiesen werden. In der Peripherie von nur einem CL cyclicum fehlte die Expression von CCL20 und CXCL8. Zwischen CL graviditatis und CL cyclica bestanden bezüglich der Genexpression keine signifikanten Unterschiede. Die Genexpression von CXCL8, CCL20 und CCL5 lag im CL-Zentrum signifikant höher, als in der CL-Peripherie, während für TNF-α eine signifikant höhere Genexpression in der Peripherie festgestellt wurde. Die fehlenden Unterschiede zwischen CL cyclica und CL graviditatis deuten auf sehr vergleichbare, immunregulative Vorgänge in physiologisch unterschiedlichen Corpora lutea hin. Die regional unterschiedliche Expression von Chemokinen und TNF-α hingegen, sowie die Unterschiede der P4-Sekretion im CL-Zentrum versus CL-Peripherie könnten auf unterschied-lichen Durchblutungsraten und differierende Immunregulationsmechanismen innerhalb des CL hinweisen. Die signifikant höheren Migrationsraten neutrophiler Granulozyten (53%) nach Einsatz von CL-Gewebekulturüberständen (verglichen zu Medium-Kontrollansätzen: 24%-30%), belegen die funktionelle Expression chemotaktischer Mediatoren im CL. Dies scheint selektiv für Neutrophile zu gelten, da ein signifikanter Einfluss auf die in-vitro-Migration von eosinophi-len Granulozyten nicht beobachtet werden konnte. Die Produktion Neutrophilen-chemotaktischer Faktoren unterschied sich nicht zwischen CL- Peripherie und CL-Zentrum, sowie auch nicht zwischen CL cyclica und CL graviditatis. Dies deckte sich mit der immun-histologisch ermittelten Zahl an Leukozyten, die sich nicht zwischen CL cyclica und CL gra-viditatis, als auch nicht zwischen CL-Peripherie und CL-Zentrum unterschied. Die sehr gerin-ge Zahl an nachgewiesenen Eosinophilen in CL-Gewebeschnitten (0-1 ± 0,4) verglichen mit der Zahl an Leukozyten, reflektierte sich ebenso in einer signifkant negativen Korrelation (r = -0,76) zwischen den Migrationsraten Eosinophiler und der Expression von TNF-α in der Peripherie.  Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurden zur Bestimmung der Genexpression oben genannter Chemokine und TNF-α während der Luteolyse bei klinisch gesunden, zyklischen Färsen an den Tagen 10 bis 12 p.ov. das CL-tragende Ovar operativ entfernt. Die Ovarentnahme erfolg-te transvaginal bei 24 Färsen 5 min, 15 min, 30 min, 120 min und 720 min nach Injektion von 25 mg des PGF2α–Analogons Dinoprost und bei 5 Färsen ohne vorherige Behandlung. Ein signifikanter Anstieg der Genexpression im Vergleich zur Kontroll-CL wurde für CCL20 720 min post injectionem (p.i.) im CL-Zentrum gemessen. Hingegen wurde eine signifikant höhere Expression für CXCL1 in der CL-Peripherie und im CL-Zentrum, bereits 15 min p.i. ermittelt, die bis zum Ende der Messungen (720 min p.i.) anhielt. Die CXCL8-Expression stieg im CL-Zentrum früher (15 min p.i.) als in der CL-Peripherie (30 min p.i.) an, und blieb in beiden Lokalisationen bis 120 min p.i. signifikant erhöht. Die TNF-α-Expression war im CL-Zentrum und in der CL-Peripherie 15 min und 30 min nach PGF2α-Applikation signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht; im CL-Zentrum konnte dies auch noch 120 min p.i. beobachtet werden. Die Expression von CCL5 lag nach Injektion von PGF2α bis zum Ende des Untersuchungszeitraumes (720 min p.i.) höher als die Kontrolle, jedoch war dies nicht signifikant. Die P4-Plasmakonzentration der PGF2α-behandelten Färsen sank gegenüber den Kontrolltieren 720 min p.i. signifikant ab. Damit modulierte eine PGF2α-Injektion signifikant das im Gelbkörper exprimierte Muster an Chemokinen und TNF-α. Dies bietet einen Hinweis auf die Beteiligung dieser Substanzen an der Luteolyse beim Rind. Ob PGF2α ebenso in vitro einen Einfluss auf die Genexpression in CL-Fragementen hat, wurde im dritten Abschnitt der Arbeit untersucht. Ebenso wurde geprüft, wie ein exogen zugegebener inflammtorischer Mediator (TNF-α) die Genexpression in CL-Fragmenten beeinflusst. Diese Studien wurden mit CL cyclica in der Blütephase von frisch geschlachteten Rindern durchgeführt. Prostaglandin F2α führte zu keinen signifikanten Veränderungen der Genexpression in der CL-Gewebekultur und beeinflusste auch nicht die P4-Konzentration in den Kulturüberständen. Hingegen führte die Inkubation von CL-Gewebe mit TNF-α zur signifikant er-höhten Expression von CXCL1, CXCL8 und TNF-α der CL-Peripherie. Die CXCL8-Expression erwies sich ebenfalls im CL-Zentrum als signifikant erhöht im Vergleich mit CL-Gewebe ohne TNF-α Applikation. Alle Chemokine und TNF-α wurden in CL cyclica von frisch geschlachteten Rindern stärker exprimiert, als in CL an den Tagen 10 bis 12 p.ov.. Signifikante Unterschiede wurden für CCL5, CCL20, CXCL1 und TNF-α ermittelt. Für CCL20 und CXCL1 galt dies in der CL-Peripherie und dem CL-Zentrum, bei CCL5 für das CL-Zentrum und bei TNF-α für die CL- Peripherie. Damit erweisen sich in-vitro-Modelle als nur begrenzt aussagekräftig für die Untersuchung zur Modulation der Chemokin- und TNF-α-Genexpression. Des Weiteren deutet diese erhöhte Expression bei den vom Schlachthof stammenden CL auf eine mögliche Beeinflussung der lutealen Chemokin- und TNF-α-Genexpression durch Entzündungen und/oder Stress hin. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit beschriebenen erstmals die Genexpression der Chemokine CXCL1, CXCL8 und CCL20 während der Blütephase des CL cylicum und des CL graviditatis beim Rind. Außerdem zeigt diese Studie deutliche Zusammenhänge zwischen der durch PGF2α–induzierten Luteolyse und einer ansteigenden Expression dieser Chemokine und TNF-α in vivo. Die fehlende Wirkung von PGF2α auf die Genexpression in vitro deutet darauf hin, dass PGF2α in vivo die Luteolyse nicht direkt, sondern indirekt über andere Mediatoren wie TNF- α induziert. Folgestudien zum luteolytischen Einfluss von PGF2α in vivo sollten sich der Frage nähren, auf welchem Wege diese Substanz zu einer veränderten Genexpression im Corpus luteum führt. Zusätzlich sollte die Bedeutung der verschiedenen, lokal und syste-misch bei Entzündungen hochregulierten, Mediatoren für die CL-Physiologie untersucht werden. Insgesamt sollten Kenntnisse über den Einfluss immunologischer Prozesse auf die Reproduktionsleistung erweitert werden, um die Fruchtbarkeit beim Milchrind in Zukunft verbessern zu können.

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Raddatz, Sybille: Untersuchungen zum Einfluss von Chemokinen und Tumor Nekrose Faktor-α auf die Funktion des Corpus luteum beim Rind während des Diöstrus, der Trächtigkeit und der Luteolyse. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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