Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Characterization of the role of the S protein of coronaviruses for virus entry

Ren, Xiaofeng

The aim of the current study was to characterize the role of the surface protein S of coronaviruses for virus entry using the following model systems: (a) severe acute respiratory syndrome associated coronavirus (SARS-CoV) S pseudotypes and (b) transmissible gastroenteritis virus (TGEV), a porcine coronavirus. The primary targets of coronaviruses are epithelial cells in the respiratory and intestinal tract. These cells have a polarized organization that includes the separation of the plasma membrane into an apical and a basolateral domain. We firstly localized the cellular receptor, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) in different polarized epithelial cells, namely, African green monkey kidney cells (Vero E6), human colon carcinoma cells (Caco-2) and human respiratory epithelial cells (Calu-3). The analysis of the filter-grown cells by surface biotinylation and confocal immunofluorescence microscopy demonstrated that ACE2 was detected exclusively on the apical plasma membrane. This result was confirmed with an MDCK cell line expressing human ACE2. To see if the apical localization of ACE2 corresponds to the site of virus entry, replication-incompetent vesicular stomatitis virus (VSV) was pseudotyped with the S protein of SARS-CoV. These virions infected polarized epithelial cells from the apical side which is consistent with the localization of the cellular receptor for SARS-CoV. In a histological analysis of the respiratory tract, ACE2 was detected in the trachea, main bronchus and alveoli, occasionally also in the small bronchi. In the second part, we investigated the importance of cholesterol, the abundant and important constituent of plasma membranes, in the initiation of an infection by TGEV. We showed that cholesterol depletion from either the cellular or viral membrane by methyl-beta-cyclodextrin (MβCD) significantly impaired the efficiency of TGEV infection. While the importance of cellular cholesterol has been shown for several other coronaviruses, the critical role of cholesterol in the viral membrane has been demonstrated for the first time for a coronavirus. This novel finding is surprising because coronaviruses bud from a pre-Golgi compartment which is known to be low in cholesterol compared to the plasma membrane. Replenishment of exogenous cholesterol resulted in a restoration of the infectivity confirming our conclusion that efficient TGEV infection requires cholesterol in both the viral and the cellular membranes. Our data raise the possibility that the viral and cellular proteins involved in the entry process may be associated with cholesterol-rich membrane microdomains. These information contributes to the understanding of the early event of virus infection and to the design of effective anti-viral strategies.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle des Oberflächenproteins S von Coronaviren beim Viruseintritt in die Zelle zu untersuchen, wobei folgende Modellsysteme zur Anwendung kamen: (a) virale Pseudoviren mit dem S-Protein des für das schwere akute respiratorische Syndrom verantwortlichen Coronavirus (SARS-CoV) und (b) das Virus der übertragbaren Gastroenteritis (TGEV), ein porzines Coronavirus. Die primären Zielzellen von Coronaviren sind die Epithelzellen im Respirations- and Darmtrakt. Diese Zellen haben eine polarisierte Organisationsform, zu der die Unterteilung der Plasmamembran in eine apikale and eine basolaterale Domäne gehört. Wir haben zunächst den zellulären Rezeptor für SARS-CoV, das angiotensin-convertierende Enzym 2 (ACE2), in verschiedenen polarisierten Epithelzellen lokalisiert, und zwar in Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (Vero E6), in humanen Colonkarzinomzellen (Caco-2) und in humanen Lungenepithelzellen (Calu-3). Die Analyse der auf Filtern gezüchteten Zellen durch Oberflächenbiotinylierung und konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte, dass ACE2 ausschließlich auf der apikalen Plasmamembran nachzuweisen war. Dieses Ergebnis wurde bestätigt mit einer MDCK-Zelllinie, die humanes ACE2 exprimierte. Um herauszufinden, ob die apikale Lokalisierung von ACE2 mit der Stelle des Viruseintritts korreliert, wurde replikationsdefektes Virus der vesikulären Stomatitis (VSV) mit dem S-Protein des SARS-CoV pseudotypisiert. Diese Virionen infizierten polarisierte Epithelzellen ausschließlich von der apikalen Seite, was mit der Lokalisierung des zellulären Rezeptors für das SARS-CoV übereinstimmt. In einer histologischen Analyse des Respirationstrakts wurde ACE2 in der Trachea, im Hauptbronchus und in den Alveolen nachgewiesen, gelegentlich auch in den Bronchiolen. Im zweiten Teil wurde die Bedeutung von Cholesterin, eines häufigen und wichtigen Bestandteils der Plasmamembran, bei der Einleitung einer TGEV-Infektion untersucht. Wir zeigten, dass der Cholesterinentzug aus entweder der Zell- oder der Virusmembran durch Methyl-β-Cyclodextrin (MβCD) sehr deutlich die Effizienz der TGEV-Infektion beeinträchtigte. Während die Bedeutung von zellulärem Cholesterin für verschiedene andere Coronaviren gezeigt worden ist, wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal bei einem Coronavirus nachgewiesen, dass Cholesterin auch in der Virusmembran eine wichtige Rolle spielt. Dieser neuartige Befund war überraschend, da Coronaviren durch einen Knospungsprozess in einem Prä-Golgi-Kompartiment reifen, das bekanntermaßen weniger Cholesterin enthält als die Plasmamembran. Die Zufuhr von exogenem Cholesterin hatte die Wiederherstellung der ursprünglichen Infektiosität zur Folge, was die Schlussfolgerung bestätigt, dass die effiziente TGEV-Infektion Cholesterin sowohl in der Zell- als auch in der Virusmembran benötigt. Aus unseren Ergebnissen lässt sich ableiten, dass die viralen und zellulären Proteine, die am Eintrittsvorgang beteiligt sind, mit cholesterin-haltigen Membranmikrodomänen assoziiert sind. Dieses Wissen trägt zum besseren Verständnis der Frühphase der Virusinfektion bei und ist hilfreich bei der Planung antiviraler Strategien.

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Ren, Xiaofeng: Characterization of the role of the S protein of coronaviruses for virus entry. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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