Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Identifizierung neuer virulenzassoziierter Faktoren von Haemophilus parasuis und Entwicklung einer Multiplex-PCR

Sack, Meike

H. parasuis is the etiological agent of Glasser’s disease and is responsible for high economic losses in the production of pork. Very little is known to date about virulence factors of H. parasuis and a prediction about the potential ability of a strain to cause disease is currently not possible. To identify putative virulence-associated genes the genomes of the reference strains of serotypes 5 (strain Nagasaki, virulent) and 11 (nonvirulent) were compared by Representational difference analysis. Five genes specific for serotype 5 were identi­fied, coding for a putative hemolysin and its export system, HhdBA, two phage pro­teins and a likely iron-responsive regulated receptor protein of the outer membrane, CirA. Since they are mainly present in virulent reference strains, the genes hhdA, hhdB and cirA were used to develop a multiplex PCR which makes it possible to check strains simultaneously for the presence of those three genes. Testing of 214 field strains gave a positive result in 33 % of the isolates for hhdA and cirA, whereas hhdB was detected only in a few strains. To evaluate the function of those genes in virulence further investigations are necessary. Comparison of protein expression of whole-cell lysates and the analysis of single proteins by mass spectrometry revealed a protein of the outer membrane (OMP P2) for every investigated strain which varied in mass from 32 to 42 kDa. No correlation between mass and virulence was observed. Reference strains 3, 6, 9 and 10 and two field strains isolated systemically express a protein of >200 kDa which could not be identified. In a challenge experiment with the reference strain of serotype 12, only one out of 12 serologically negative piglets developed clinical symptoms, however, Mycoplasma hyorhinis was reisolated. The strain used for challenge showed a high genetic simi­larity to an isolate which was shown to be present in the animals before starting the infection trial, indicating that protective maternal antibodies which were not detected by ELISA might have been present in the piglets during the curse of infection. In this study five new putativly virulence associated genes of H. parasuis were identi­fied. The function and role of which in virulence of H. parasuis has to be ana­lysed by functional characterization.

H. parasuis ist als Erreger der Glässerschen Krankheit für hohe wirtschaftliche Ver­luste im Bereich der Schweinefleischproduktion verantwortlich. Die Virulenzfaktoren des Erregers sind noch weitestgehend unbekannt und eine Aussage über das Viru­lenzpotenzial eines Stammes ist bislang nicht möglich. Zur Identifizierung möglicher virulenzassoziierter Gene wurden die Genome der Referenzstämme von Serotyp 5 (Stamm Nagasaki, virulent) und 11 (avirulent) per Repräsentativer Dif­ferenzanalyse verglichen. Es wurden fünf Serotyp 5 spezifische Gene identifiziert, sie kodieren für ein putatives Hämolysin und seine Trans­port­einheit, HhdBA, zwei puta­tive Phagenproteine sowie ein möglicherweise eisen­ab­hängiges Rezeptorprotein der äußeren Membran, CirA. Mit den überwiegend in viru­lenten Stämmen vorkommen­den Genen hhdA, hhdB und cirA wurde eine Multi­plex-PCR entwickelt, die die gleich­zeitige Überprüfung auf das Vorkommen der drei Gene ermöglicht. In einer Untersu­chung von 214 Feldstämmen waren ca. 33 % positiv für die Gene hhdA und cirA, hhdB wurde jedoch nur in wenigen Stämmen nach­gewiesen. Zur Beurteilung der Rolle dieser Gene in der Virulenz sind weitere Unter­suchungen notwendig. Vergleiche der Proteinexpression (Ganzzelllysate) und die Analyse einzelner Pro­teine mittels Massenspektrometrie ergaben, dass sämtliche untersuchten Stämme ein Protein der äußeren Membran (OMP P2) exprimieren, dessen Masse zwischen 32 und 42 kDa schwankt. Ein Zusammenhang zwischen Proteingröße und Virulenz eines Isolates konnte nicht beobachtet werden. Die unterschiedlich virulenten Refe­renzstämme 3, 6, 9 und 10 sowie zwei invasive Feldstämme exprimieren ein Protein von >200 kDa, welches nicht identifiziert werden konnte. In einem Infektionsversuch mit dem Referenzstamm von Serotyp 12 entwickelte von 12 serologisch negativen Ferkeln nur eines klinische Symptome, aus den Läsionen wurde jedoch Mycoplasma hyorhinis nachgewiesen. Der Belastungsstamm wies genetisch hohe Ähnlichkeiten mit einem bereits vor der Infektion in allen Tieren nachgewiesen Stamm auf, so dass sie vermutlich protektive maternale Antikörper besaßen, die mittels ELISA nicht detektiert wurden. In dieser Studie wurden fünf neue putative virulenzassoziierte Gene von H. parasuis identifiziert. Ihre Funktion und Rolle in der Virulenz des Erregers muss nachfolgend durch eine funktionelle Charakterisierung untersucht werden. 

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Sack, Meike: Identifizierung neuer virulenzassoziierter Faktoren von Haemophilus parasuis und Entwicklung einer Multiplex-PCR. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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