Etablierung und Vaidierung einer Real-Time-PCR zur Detektion der Oozysten von Toxoplasma gondii

Die Toxoplasmose gehört zu den weltweit häufigsten Zoonosen und kann sowohl beim Tier als auch beim Menschen Aborte und schwere konnatale Erkrankungen verursachen. Während für den Nachweis einer Infektion mit dem Erreger, Toxoplasma gondii, bei Zwischen- und Endwirten zahlreiche diagnostische Methoden zur Verfügung stehen, wurden bisher nur unzulängliche Methoden für den Nachweis der Entwicklungsstadien des Parasiten in Umweltproben entwickelt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer T.-gondii-spezifischen Real-Time-PCR, die unsporulierte und sporulierte Oozysten von T. gondii nachweisen und quantifizieren kann. Zunächst wurde eine Real-Time-PCR für das B1-Gen von T. gondii entwickelt. Die Evaluierung dieser Real-Time-PCR mit drei virulenten (BK, ENT, RH), sieben avirulenten (Beverley, C, DX, Fukaya, GTP, ME49, TPR), einem noch nicht weiter klassifierten Stamm (KSH) und dem Vakzine-Stamm (S48) von T. gondii zeigte, dass die Quantifizierung des Parasiten mit dieser Methode bis zu einer Nachweisgrenze von 100 Kopien des B1-Gens (entsprechend 3 haploiden Stadien von T. gondii) möglich ist. Die Spezifität der Methode wurde mit genomischen DNA-Templates von phylogenetisch eng mit T. gondii verwandten Parasiten (Hammondia hammondi, Neospora caninum, Isospora felis, Sarcocystis sp.) evaluiert. Dabei gab es keine Kreuzreaktionen. Die weitere Evaluierung der B1-Gen-Real-Time-PCR zeigte, dass sich mit dieser Methode zehn unsporulierte und eine sporulierte Oozyste von T. gondii nachweisen lassen. Ergänzend wurde eine weitere Real-Time-PCR auf der Basis der noch wenig erforschten 529-bp-Repeat-Region von T. gondii entwickelt. Die Auswertung dieser Real-Time-PCR mit drei virulenten (BK, ENT, RH), sieben avirulenten (Beverley, C, DX, Fukaya, GTP, ME49, TPR), zwei noch nicht weiter klassifierten Stämmen (KSH1, AHC-1) und dem Vakzine-Stamm (S48) von T. gondii zeigte, dass der Nachweis des Protozoon mit dieser Methode bis zu einer Grenze von 500 fg genomischer DNA von T. gondii sicher möglich ist, was einer Sensitivität von 6,25 haploiden Stadien von T. gondii entspricht. Die Spezifität der Real-Time-PCR wurde mit genomischen DNA-Templates von phylogenetisch eng mit T. gondii verwandten Parasiten (H. hammondi, N. caninum, B. besnoiti, I. felis, E. tenella, Sarcocystis sp.) evaluiert. Dabei zeigte sich, dass die Real-Time-PCR auf der Basis der 529-bp-Repeat-Region spezifisch für T. gondii ist. Mit der Real-Time-PCR ließen sich weniger als eine unsporulierte Oozyste und weniger als eine sporulierte Oozyste nachweisen. Die hier beschriebene Real-Time-PCR auf Basis der 529-bp-Repeat-Region von T. gondii ist die erste Real-Time-PCR für dieses Genfragment zum Nachweis von unsporulierten und sporulierten T.-gondii-Oozysten.