Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Etablierung und Vaidierung einer Real-Time-PCR zur Detektion der Oozysten von Toxoplasma gondii

Vorwerk, Nikola

Toxoplasmosis is one of the most common zoonotic infections worldwide and can cause abortion and severe connatal diseases in animals and humans. Most studies on diagnosis of toxoplasmosis concern with infection in human and animal hosts. Methods for the detection of infectious stages of the parasite, Toxoplasma gondii, in environmental samples are rare and often inadequate. The goal of this project was the development of a T.-gondii-specific real-time PCR that enables the qualitative and quantitative detection of unsporulated and sporulated oocysts of T. gondii. First we developed a real-time-PCR based on the detection of the T. gondii B1 gene. Sensitivity assessment of this method with three virulent strains (BK, ENT, RH), seven non-virulent strains (Beverley, C, DX, Fukaya, GTP, ME49, TPR), one non-classified strain (KSH) and the vaccine strain (S48) of T. gondii showed that quantification is possible with a detection limit of 100 copies of the B1 gene respectively three haploid stages of T. gondii per test sample. No cross-amplifications were observed with genomic DNA templates derived from parasites that are phylogenetically related to T. gondii (Hammondia hammondi, Neospora caninum, Isospora felis, Sarcocystis spp.). Further evaluation of this method revealed a detection limit of ten unsporulated and one sporulated oocyst of T. gondii per test sample. Additionally we developed a second real-time-PCR based on the more recently described 529-bp-repeat-region of T. gondii. Evaluation of this method with three virulent strains (BK, ENT, RH), seven non-virulent strains (Beverley, C, DX, Fukaya, GTP, ME49, TPR), two non-classified strains (KSH1, AHC-1) and the vaccine strain (S48) showed a reliable detection limit of 500 fg genomic DNA respectively 6,25 haploid stages of T. gondii per test sample. Specifity of the real-time-pcr was evaluated with genomic DNA templates from parasites that are phylogenetically related to T. gondii (H. hammondi, N. caninum, B.  besnoiti, I.felis, E. tenella, Sarcocystis spp.). The tests showed that the real-time-pcr based on the 529-bp-repeat-region is specific for T. gondii. With this method less than one unsporulated and less than one sporulated oocyst of T. gondii per test sample could be detected. The real-time-pcr based on the 529-bp-Repeat-Region described here is the first real-time pcr for this target to detect unsporulated and sporulated oocysts of T. gondii.

Die Toxoplasmose gehört zu den weltweit häufigsten Zoonosen und kann sowohl beim Tier als auch beim Menschen Aborte und schwere konnatale Erkrankungen verursachen. Während für den Nachweis einer Infektion mit dem Erreger, Toxoplasma gondii, bei Zwischen- und Endwirten zahlreiche diagnostische Methoden zur Verfügung stehen, wurden bisher nur unzulängliche Methoden für den Nachweis der Entwicklungsstadien des Parasiten in Umweltproben entwickelt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer T.-gondii-spezifischen Real-Time-PCR, die unsporulierte und sporulierte Oozysten von T. gondii nachweisen und quantifizieren kann. Zunächst wurde eine Real-Time-PCR für das B1-Gen von T. gondii entwickelt. Die Evaluierung dieser Real-Time-PCR mit drei virulenten (BK, ENT, RH), sieben avirulenten (Beverley, C, DX, Fukaya, GTP, ME49, TPR), einem noch nicht weiter klassifierten Stamm (KSH) und dem Vakzine-Stamm (S48) von T. gondii zeigte, dass die Quantifizierung des Parasiten mit dieser Methode bis zu einer Nachweisgrenze von 100 Kopien des B1-Gens (entsprechend 3 haploiden Stadien von T. gondii) möglich ist. Die Spezifität der Methode wurde mit genomischen DNA-Templates von phylogenetisch eng mit T. gondii verwandten Parasiten (Hammondia hammondi, Neospora caninum, Isospora felis, Sarcocystis sp.) evaluiert. Dabei gab es keine Kreuzreaktionen. Die weitere Evaluierung der B1-Gen-Real-Time-PCR zeigte, dass sich mit dieser Methode zehn unsporulierte und eine sporulierte Oozyste von T. gondii nachweisen lassen. Ergänzend wurde eine weitere Real-Time-PCR auf der Basis der noch wenig erforschten 529-bp-Repeat-Region von T. gondii entwickelt. Die Auswertung dieser Real-Time-PCR mit drei virulenten (BK, ENT, RH), sieben avirulenten (Beverley, C, DX, Fukaya, GTP, ME49, TPR), zwei noch nicht weiter klassifierten Stämmen (KSH1, AHC-1) und dem Vakzine-Stamm (S48) von T. gondii zeigte, dass der Nachweis des Protozoon mit dieser Methode bis zu einer Grenze von 500 fg genomischer DNA von T. gondii sicher möglich ist, was einer Sensitivität von 6,25 haploiden Stadien von T. gondii entspricht. Die Spezifität der Real-Time-PCR wurde mit genomischen DNA-Templates von phylogenetisch eng mit T. gondii verwandten Parasiten (H. hammondi, N. caninum, B. besnoiti, I. felis, E. tenella, Sarcocystis sp.) evaluiert. Dabei zeigte sich, dass die Real-Time-PCR auf der Basis der 529-bp-Repeat-Region spezifisch für T. gondii ist. Mit der Real-Time-PCR ließen sich weniger als eine unsporulierte Oozyste und weniger als eine sporulierte Oozyste nachweisen. Die hier beschriebene Real-Time-PCR auf Basis der 529-bp-Repeat-Region von T. gondii ist die erste Real-Time-PCR für dieses Genfragment zum Nachweis von unsporulierten und sporulierten T.-gondii-Oozysten.

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Vorwerk, Nikola: Etablierung und Vaidierung einer Real-Time-PCR zur Detektion der Oozysten von Toxoplasma gondii. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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