Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Induced spermiation and sperm morphology in the Green Poison Frog, Dendrobates auratus

Lipke, Christian

In general induced spermiation in amphibians is performed to investigate endocrine conditions and rarely with the aim of conservation. The operability of hormonal induced spermiation in dendrobatid frogs using human chorionic gonadotropin (hCG) as well as spermatological studies including light (LM), fluorescent (FM), and electron microscopic (EM) investigations remains to be determined. In the light of worldwide amphibian declines alternative investigations to the studies exploring causes for the massive losses examinations in the field of reproduction were performed. In the Green Poison Frog, Dendrobates auratus, two different spermiation protocols were carried out to characterize differences in the spermiation response between 5 min and 240 min after injections of hCG into the dorsal lymph sac. In addition, two sperm media, isotonic phosphate-free amphibian saline (IPS) and Xenopus fertilization medium (XB) were compared regarding motility of released sperm cells. The morphology of spermatozoa was described using LM and both transmission (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). A preparation method for single sperm cells in low concentration for electron microscopic purposes was established. Sperm membrane integrity was examined by propidium iodide (PI) staining behavior in fluorescent microscopy and membrane morphology evaluated in light microscopy. Sperm cells with altered conformation were also quantified and divided into four groups (1) major rest of cytoplasm drop; (2) immature round-head; (3) defective head with faulty membrane integrity; (4) defective tail. A double stimulation of 100 IU hCG each at intervals of one hour was most effective inducing spermiation in D. auratus (96.9 %) joined with distinct higher total numbers of sperm compared to single injections of 100 IU hCG. With XB a medium was tested providing a significantly higher number (P<0.05) and percentage (P<0.001) of motile spermatozoa coming from cloaca flushings of hormonal stimulated dendrobatid frogs than the IPS medium. With 79.3 %, the majority of all sperm cells showed a typical morphology and viability. Recovered typically formed spermatozoa of D. auratus (total length: 56.1 ± 5.5 µm) consisted of curved, filiform head and a single flagellum lacking accessory structures. For EM sperm samples were deposited on microscopic slides and fixated with Karnovsky fixative. Thusly handling and further preparation of sperm cell samples in low concentration was achieved. Typical structures for dendrobatid sperm cell as the acrosomal complex consisting of acrosomal vesicle and subacrosomal cone, nuclear inclusions containing granular material and a short midpiece showing a mitochondrial collar with a proximal and a distal centriole were found. Admittedly, with D. auratus the first member of the Dendrobatidae lacking an undulating membrane attached to the axoneme was described. Results also indicate a correlation between morphological alterations of the cytoplasm membrane and the PI staining behavior. Observation concerning the membrane state of spermatozoa seen in light and fluorescent microscopy conformed. Cells showing numerous bullous protrusions in the head area in LM were evaluated membrane-defect in PM. A controlled and gentle method for dendrobatid sperm cell recovery in vivo combined with spermatological investigations demonstrate the pre-conditions for assisted amphibian breeding programs as a strategy to confront the worldwide amphibian declines. Possible applications within these projects are assisted mating, artificial fertilization and preservation of gametes and embryos. Implementation of induced spermiation in veterinary practice may be useful for sexing in species lacking external sex dimorphism or evaluating male fertility. The finding of a unique sperm tail conformation for dendrobatid frogs suggest not only a diversity of this feature within the Dendrobatidae but may also contribute together with behavioral observations, studies on morphological characteristics and molecular methods to understanding of amphibian phylogeny.

Die induzierte Spermiation wird bei Amphibien fast ausschließlich durchgeführt, um endokrine Zusammenhänge zu untersuchen, nur selten steht der Artenschutz im Vordergrund. Ein Nachweis der Anwendbarkeit der hormonell induzierten Spermiation bei Baumsteigerfröschen nach Applikation von humanem Choriongonadotropin (hCG) sowie spermatologische Untersuchungen einschließlich lichtmikroskopischer, fluoreszenzmikroskopischer und elektronenmikroskopischer Studien stehen noch aus. Vor dem Hintergrund des weltweiten Amphibiensterbens wurden zu den Arbeiten, welche Gründe der massiven Verluste zu klären versuchten, alternative reproduktionsbiologische Studien durchgeführt. Es wurden Unterschiede bei der induzierten Spermienabgabe des Goldbaumsteigerfrosches, Dendrobates auratus, zwischen 5 min und 240 min nach der Injektion von hCG in den dorsalen Lymphsack charakterisiert. Darüber hinaus wurden zwei Medien, eine isotonische phosphatfreie Kochsalzlösung sowie ein „Xenopus fertilization“ Medium (XB) hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Motilität abgegebener Spermien zu gewährleisten, untersucht. Die Beschreibung der Spermienmorphologie erfolgte mit licht- sowie transmissionselektronen- und rasterelektronenmikroskopischen Verfahren. Dazu wurde eine Methode zur elektronenmikroskopischen Probenaufarbeitung für niedrig konzentrierte Einzel-Zellen etabliert. Die Membranintegrität der Spermatozoen wurde anhand des Färbeverhaltens mit Propidiumjodid (PI) sowie der Morphologie der äußeren Zellmembran im Lichtmikroskop untersucht. Neben typisch geformten Zellen wurden auch pathologische Spermienformen quantifiziert und in vier Gruppen eingeteilt: (1) großer Zytoplasmatropfen; (2) unreife Rundzelle; (3) Kopfdefekt mit Schädigung der Zytoplasmamembran; (4) Schwanzdefekt. Die effektivste Gewinnung von Spermien bei D. auratus (96,9 %) konnte nach doppelter Stimulation mit jeweils 100 IE hCG im Abstand von einer Stunde erreicht werden. Unter Verwendung des XB Mediums wurden signifikant höhere absolute (P<0,05) und relative (P<0,001) Anzahlen motiler Spermien aus den Kloaken hormonell behandelter Frösche gewonnen als unter Verwendung des IPS Mediums. Die Mehrzahl der Spermatozoen wies eine typische Morphologie und Viabilität auf (79,3 %). Diese Zellen (Gesamtlänge: 56,1 ± 5,5 µm) bestehen aus einem gebogenen, filiformen Kopfstück sowie einem einzelnen Spermienschwanz ohne akzessorische Strukturen. Für die ultrastrukturellen Untersuchungen wurden die Spermienproben auf Objektträger gegeben und mit Karnovksy-Lösung fixiert. Auf diese Weise konnte eine praktische Handhabung für die weiteren Vorbereitungsschritte der Elektronenmikroskopie von Einzelzell-Proben in nur geringer Konzentration erreicht werden. Bei den ultrastrukturellen Studien wurden die für Spermien der Dendrobaten typischen Strukturen (akrosomaler Komplex bestehend aus akrosomalem Vesikel und subakrosomalem Konus, nukleäre Inklusionen aus granulärem Material, kurzes Mittelstück mit proximaler und distaler Zentriole) gefunden. Allerdings konnte mit D. auratus der erste Vertreter der Baumsteigerfrösche beschrieben werden, dessen Spermien-Flagellae lediglich aus einem Axonem ohne undulierende Membran bestehen. Die Ergebnisse deuten außerdem auf eine Korrelation zwischen morphologischen Veränderungen der äußeren Zellmembran gewonnener Spermatozoen und dem PI Färbeverhalten hin. Zellen, die lichtmikroskopisch zahlreiche blasige Auftreibungen im Kopfbereich besaßen, konnten mit Hilfe der PI Färbung als membrandefekt identifiziert werden. Die kontrollierte und schonende Spermiengewinnung beim Baumsteigerfrosch in vivo bietet, verbunden mit der Möglichkeit spermatologischer Untersuchungen, die Voraussetzungen für assistierte Zuchtprogramme, mit denen auf das weltweite Amphibiensterben reagiert werden kann. Assistierte Paarung, künstliche Befruchtung und Konservierung von Gameten und Embryonen stellen mögliche Anwendungen innerhalb solcher Projekte dar. Die Durchführung der induzierten Spermiation im Rahmen der tierärztlichen Praxis kann sich bei der Geschlechtsbestimmung solcher Amphibienarten als sinnvoll herausstellen, die keinen äußerlich erkennbaren Geschlechtsdimorphismus aufweisen. Eine genauere Diagnostik der männlichen Infertilität wird ebenfalls ermöglicht. Die Entdeckung einer bislang einzigartigen Struktur des Spermienschwanzes bei einem Baumsteigerfrosch weist nicht nur auf eine Heterogenität dieses Merkmals auf Familienniveau hin, sondern kann gemeinsam mit Verhaltensbeobachtungen, Studien zur äußeren Morphologie und molekularbiologischen Methoden dazu beitragen, die Phylogenie der Amphibien zu klären.

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Lipke, Christian: Induced spermiation and sperm morphology in the Green Poison Frog, Dendrobates auratus. Hannover 2008. Tierärztliche Hochschule.

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