Induced spermiation and sperm morphology in the Green Poison Frog, Dendrobates auratus

Die induzierte Spermiation wird bei Amphibien fast ausschließlich durchgeführt, um endokrine Zusammenhänge zu untersuchen, nur selten steht der Artenschutz im Vordergrund. Ein Nachweis der Anwendbarkeit der hormonell induzierten Spermiation bei Baumsteigerfröschen nach Applikation von humanem Choriongonadotropin (hCG) sowie spermatologische Untersuchungen einschließlich lichtmikroskopischer, fluoreszenzmikroskopischer und elektronenmikroskopischer Studien stehen noch aus. Vor dem Hintergrund des weltweiten Amphibiensterbens wurden zu den Arbeiten, welche Gründe der massiven Verluste zu klären versuchten, alternative reproduktionsbiologische Studien durchgeführt. Es wurden Unterschiede bei der induzierten Spermienabgabe des Goldbaumsteigerfrosches, Dendrobates auratus, zwischen 5 min und 240 min nach der Injektion von hCG in den dorsalen Lymphsack charakterisiert. Darüber hinaus wurden zwei Medien, eine isotonische phosphatfreie Kochsalzlösung sowie ein „Xenopus fertilization“ Medium (XB) hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Motilität abgegebener Spermien zu gewährleisten, untersucht. Die Beschreibung der Spermienmorphologie erfolgte mit licht- sowie transmissionselektronen- und rasterelektronenmikroskopischen Verfahren. Dazu wurde eine Methode zur elektronenmikroskopischen Probenaufarbeitung für niedrig konzentrierte Einzel-Zellen etabliert. Die Membranintegrität der Spermatozoen wurde anhand des Färbeverhaltens mit Propidiumjodid (PI) sowie der Morphologie der äußeren Zellmembran im Lichtmikroskop untersucht. Neben typisch geformten Zellen wurden auch pathologische Spermienformen quantifiziert und in vier Gruppen eingeteilt: (1) großer Zytoplasmatropfen; (2) unreife Rundzelle; (3) Kopfdefekt mit Schädigung der Zytoplasmamembran; (4) Schwanzdefekt. Die effektivste Gewinnung von Spermien bei D. auratus (96,9 %) konnte nach doppelter Stimulation mit jeweils 100 IE hCG im Abstand von einer Stunde erreicht werden. Unter Verwendung des XB Mediums wurden signifikant höhere absolute (P<0,05) und relative (P<0,001) Anzahlen motiler Spermien aus den Kloaken hormonell behandelter Frösche gewonnen als unter Verwendung des IPS Mediums. Die Mehrzahl der Spermatozoen wies eine typische Morphologie und Viabilität auf (79,3 %). Diese Zellen (Gesamtlänge: 56,1 ± 5,5 µm) bestehen aus einem gebogenen, filiformen Kopfstück sowie einem einzelnen Spermienschwanz ohne akzessorische Strukturen. Für die ultrastrukturellen Untersuchungen wurden die Spermienproben auf Objektträger gegeben und mit Karnovksy-Lösung fixiert. Auf diese Weise konnte eine praktische Handhabung für die weiteren Vorbereitungsschritte der Elektronenmikroskopie von Einzelzell-Proben in nur geringer Konzentration erreicht werden. Bei den ultrastrukturellen Studien wurden die für Spermien der Dendrobaten typischen Strukturen (akrosomaler Komplex bestehend aus akrosomalem Vesikel und subakrosomalem Konus, nukleäre Inklusionen aus granulärem Material, kurzes Mittelstück mit proximaler und distaler Zentriole) gefunden. Allerdings konnte mit D. auratus der erste Vertreter der Baumsteigerfrösche beschrieben werden, dessen Spermien-Flagellae lediglich aus einem Axonem ohne undulierende Membran bestehen. Die Ergebnisse deuten außerdem auf eine Korrelation zwischen morphologischen Veränderungen der äußeren Zellmembran gewonnener Spermatozoen und dem PI Färbeverhalten hin. Zellen, die lichtmikroskopisch zahlreiche blasige Auftreibungen im Kopfbereich besaßen, konnten mit Hilfe der PI Färbung als membrandefekt identifiziert werden. Die kontrollierte und schonende Spermiengewinnung beim Baumsteigerfrosch in vivo bietet, verbunden mit der Möglichkeit spermatologischer Untersuchungen, die Voraussetzungen für assistierte Zuchtprogramme, mit denen auf das weltweite Amphibiensterben reagiert werden kann. Assistierte Paarung, künstliche Befruchtung und Konservierung von Gameten und Embryonen stellen mögliche Anwendungen innerhalb solcher Projekte dar. Die Durchführung der induzierten Spermiation im Rahmen der tierärztlichen Praxis kann sich bei der Geschlechtsbestimmung solcher Amphibienarten als sinnvoll herausstellen, die keinen äußerlich erkennbaren Geschlechtsdimorphismus aufweisen. Eine genauere Diagnostik der männlichen Infertilität wird ebenfalls ermöglicht. Die Entdeckung einer bislang einzigartigen Struktur des Spermienschwanzes bei einem Baumsteigerfrosch weist nicht nur auf eine Heterogenität dieses Merkmals auf Familienniveau hin, sondern kann gemeinsam mit Verhaltensbeobachtungen, Studien zur äußeren Morphologie und molekularbiologischen Methoden dazu beitragen, die Phylogenie der Amphibien zu klären.